番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)譜及其功能的初步研究.pdf

1、植物在面對(duì)大自然中各種生物脅迫和非生物脅迫時(shí)會(huì)采用多種機(jī)制來適應(yīng)環(huán)境。在植物與自然的相互作用研究過程中，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注植物體在基因水平上的調(diào)節(jié)作用。近幾年，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究已逐漸成為當(dāng)今植物基因組的一個(gè)熱點(diǎn)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物體中起著應(yīng)答各種生物脅迫與非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)作用，分離植物WRKY家族的不同成員并鑒定其功能是闡明植物抗逆分子機(jī)制的重要途徑。
　　 本研究首先利用SUPERFAMILY數(shù)據(jù)庫，得到推測(cè)的番

2、木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，借助Genebank數(shù)據(jù)庫資源建立了本地的番木瓜Genome和EST數(shù)據(jù)庫，從而利用tBlastn工具獲得了番木瓜45個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。對(duì)其中13個(gè)WRKY基因進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)水平，選取其中一個(gè)表達(dá)差異明顯的WRKY基因進(jìn)行初步的功能研究。現(xiàn)主要獲得以下結(jié)果：
　　 1.在番木瓜中發(fā)現(xiàn)45個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，獲得其推測(cè)的基因編碼序列，并將其分為4類。在

3、SUPERFAMILY數(shù)據(jù)庫中搜索得到56個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域分布于50個(gè)蛋白質(zhì)中，經(jīng)過序列比對(duì)、除去冗余之后得到45個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子及氨基酸序列。借助已經(jīng)完成測(cè)序的番木瓜基因組，利用tBlastn工具獲得了這45個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。根據(jù)所含WRKY結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，將其分為4類：第Ⅰ類含有6個(gè)，第Ⅱ類含有30個(gè)，第Ⅲ類含有7個(gè)，第Ⅳ類含有2個(gè)。
　　 2.通過水楊酸(SA)、低溫、干旱、創(chuàng)傷、病原侵染

4、等多種脅迫誘導(dǎo)，得到13個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)譜。利用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)脅迫處理后的番木瓜苗在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，檢測(cè)其中13個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，這13個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子除evm.TU.supercontig_1.102(以下簡(jiǎn)稱為TF1.102)外，其他轉(zhuǎn)錄WRKY因子受生物脅迫或非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中TF12.199，TF807.3，TF9.353個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)5種處理都受誘導(dǎo)，說明

5、這13個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中有12個(gè)或多或少在抗脅迫反應(yīng)中起到了一定的調(diào)控作用。
　　 3.成功克隆得到一個(gè)番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)。分析番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)譜，選取其中一個(gè)表達(dá)差異明顯的WRKY基因TF8073進(jìn)行RT-PCR克隆，得到了一個(gè)558bp的cDNA序列，經(jīng)測(cè)序與蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析，確定其為番木瓜WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。
　　 4.利用農(nóng)桿菌滲透法，將TF807.3在番木瓜葉片

6、中瞬時(shí)超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)番木瓜抗病相關(guān)基因CpSGT1和CpRAR1表達(dá)水平明顯上調(diào)。通過構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA3300-TF807.3，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番木瓜瞬時(shí)表達(dá)體系，分析TF8073超表達(dá)的番木瓜葉片中抗病相關(guān)基因SGT1和RAR1的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在農(nóng)桿菌侵染3d后，TF8073在番木瓜葉片中得到超表達(dá)，SGT1和RAR1的表達(dá)量分別上調(diào)2.4倍和4.5倍，說明TF807.3參與到SGT1和