流感病毒NA基因聯(lián)合雞Mx基因制備抗病轉(zhuǎn)基因雞的研究.pdf

1、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)是流感病毒表面的糖蛋白之一，具有糖苷外切酶活性。NA在病毒的侵入和傳播過(guò)程中起非常重要的作用。NA的主要作用是消除病毒顆粒表面及感染細(xì)胞表面的唾液酸，對(duì)病毒粒子的釋放以及防止病毒粒子的聚集很重要，既能夠降解流感病毒識(shí)別的宿主細(xì)胞上的受體—唾液酸殘基;同時(shí)NA也具有免疫原性，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體可以對(duì)同種病毒的攻擊提供完全保護(hù)，并可對(duì)同亞型不同病毒株的攻擊提供交叉保護(hù)。NA這一獨(dú)特功能對(duì)

2、防治禽流感病毒(AIV)具有重要的意義，使其成為國(guó)內(nèi)外抗禽流感病毒研究的熱點(diǎn)之一。Mx(myxo-virusresistance)基因，即抗粘液病毒基因，是由干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的抗病毒蛋白家族中的成員之一，經(jīng)Ⅰ型(α/β)和Ⅲ型（λ)干擾素、雙股RNA或病毒誘導(dǎo)可產(chǎn)生抗病毒Mx蛋白，具有獨(dú)特的抗禽流感病毒作用。有研究表明雞Mx蛋白631位氨基酸多肽性與其抗病毒活性密切相關(guān)，當(dāng)其為天冬酰胺時(shí)Mx蛋白有抗病毒活性。本實(shí)驗(yàn)研究的目的在于嘗試將被動(dòng)

3、誘導(dǎo)的Mx蛋白基因與可發(fā)生主動(dòng)誘導(dǎo)免疫的NA基因，分別單獨(dú)構(gòu)建表達(dá)載體以及構(gòu)建Mx-NA雙基因表達(dá)載體，比較NA基因、Mx基因、Mx-NA聯(lián)合基因表達(dá)產(chǎn)物的抗病效果。利用睪丸注射法將構(gòu)建的上述雙基因共表達(dá)的重組載體導(dǎo)入體內(nèi)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞，為培育抗禽流感轉(zhuǎn)基因雞開(kāi)辟新途徑。主要內(nèi)容如下:
　　 1.NA基因和Mx基因的克隆、序列分析及重組真核雙表達(dá)載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)合成NA基因和Mx基因特異性引物，采用PCR方法克隆出雞源H5N1型禽流

4、感病毒NA基因和中國(guó)狼山雞Mx基因的cDNA。將NA基因和Mx基因擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-TVector中，酶切與測(cè)序結(jié)果表明pMD19-T-NA和pMD19-T-Mx構(gòu)建正確。然后將NA和Mx基因克隆至真核表達(dá)載體PVITRO2中，構(gòu)建單基因真核表達(dá)載體PVITRO2-Mx和PVITRO2-NA以及雙基因表達(dá)載體PVITRO2-Mx-NA，酶切與測(cè)序結(jié)果均表明單基因和雙基因表達(dá)載體構(gòu)建正確。序列分析結(jié)果表明:
　　 ①雞源H

5、5N1型禽流感病毒NA基因與人源H5N1型同源性最高，其所編碼的親水性NA蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)及質(zhì)膜附近，屬于分泌型跨膜蛋白。
　　 ②狼山雞與肉雞的Mx基因同源性最高，Mx蛋白為親水性的非分泌型蛋白，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 2.體外重組“PVITRO2-Mx-NA”的表達(dá)及其亞細(xì)胞定位研究。首先本試驗(yàn)利用Mx蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Mx免疫BALB/C小鼠，初步制備了抗Mx蛋白的抗體血清，并且確定了該抗體

6、血清的效價(jià)為1:100。用電轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)表達(dá)載體PVITRO2-Mx-NA轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞系，48h后進(jìn)行篩選，之后提取所獲得陽(yáng)性細(xì)胞的總RNA。通過(guò)RT-PCR以及間接免疫熒光方法(IFA)鑒定該聯(lián)合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。熒光倒置顯微鏡下觀察，重組Mx和NA蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)無(wú)熒光，說(shuō)明重組載體pVITRO2-Mx-NA成功表達(dá)了重組Mx和NA蛋白。這為建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及制備轉(zhuǎn)基因雞奠定基礎(chǔ)。
　　 3.重

7、組表達(dá)載體“PVITRO2-Mx-NA”抗病活性的研究。通過(guò)電轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)PVITRO2-Mx-NA轉(zhuǎn)染雞成纖維(CEF)細(xì)胞，48h后提取CEF細(xì)胞的總RNA并通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)Mx和NA基因的表達(dá)。然后采用微量細(xì)胞病變抑制法CEF—NDV系統(tǒng)測(cè)定雞重組Mx蛋白和NA蛋白的聯(lián)合抗病毒作用，并且設(shè)立單基因抗病毒組，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析來(lái)研究各實(shí)驗(yàn)組抗病毒效果的差異;同時(shí)我們使用已制備的Mx和NA蛋白抗體進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)作為陽(yáng)性對(duì)照。

8、兩種蛋白對(duì)新城疫病毒(NDV)感染的聯(lián)合抑制能力顯示:聯(lián)合應(yīng)用Mx和NA蛋白可以有效的提高細(xì)胞對(duì)新城疫病毒的抵抗力，并且優(yōu)于單基因的抗病效果;兩種抗體聯(lián)合使用攻毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同時(shí)驗(yàn)證了這一結(jié)果。
　　 4.睪丸注射法制備抗病轉(zhuǎn)基因雞的研究。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將線性化的重組載體PVITRO2-Mx-NA通過(guò)隨機(jī)打點(diǎn)注射入性成熟的公雞睪丸內(nèi)。首次注射1周后重復(fù)注射1次，并于注射后25d，50d，60d，70d采集其精液，將精液基因組