雞Mx基因克隆及表達分析.pdf

1、Mx蛋白是在IFN誘導(dǎo)下產(chǎn)生的抗病毒蛋白質(zhì)，禽類的Mx蛋白具有抵抗禽流感病毒及水皰性口炎病毒(VSV)的功能，由于禽類是禽流感的自然宿主，因此對禽類Mx蛋白基因進行研究具有重要意義。本研究以中國地方品種——北京油雞(BeiJing-You,BJY)和引進品種——白來航(WhiteLoghom,WLH)作為實驗動物，采用SSCP，RFLP分析方法研究GED區(qū)的變異，獲得Mx蛋白基因全全長并對基因組結(jié)構(gòu)進行分析；同時進行了誘導(dǎo)條件下兩個不同

2、品種Mx蛋白基因表達差異的研究及原核表達載體的優(yōu)化及表達研究。所得結(jié)果如下： GED區(qū)是Mx蛋白執(zhí)行抗病毒的功能區(qū)域，應(yīng)用PCR-SSCP和PCR-RFLP的方法對GED區(qū)進行研究，通過北京油雞(n=150)和白來航(n=150)兩個品種Mx基因GED區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)在631位點氨基酸對應(yīng)的2216堿基突變的基因型及基因頻率在兩個品種中存在顯著差異。其中，白來航等位基因(抗病基因)A的頻率0.8471顯著高于北京油雞(0.1613)

3、；相反，北京油雞等位基因B(易感基因)的頻率(0.8387)顯著高于白來航(0.1529)。X2獨立性檢驗表明在兩個不同的品種間，該位點的基因型分布存在極顯著的差異，白來航AA基因型的頻率顯著高于北京油雞。兩個群體在P2-SSCP位點上基因型和基因頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。 由丁對2216突變位點進行PCR-RFLP研究時無合適的限制性核酸內(nèi)切酶，為方便進行突變位點的檢測，實驗中設(shè)計錯配堿基產(chǎn)生合適的酶切位

4、點，建立了一套快速檢測Mx基因2216突變位點的檢測體系，結(jié)果穩(wěn)定可靠。 通過polyI：C誘導(dǎo)，獲得了雞Mx蛋白基因全長序列，GenBank提交序列號EU348752。測序結(jié)果預(yù)測的氨基酸顯示631位是Asn，可以作為轉(zhuǎn)基因的外源DNA序列進行轉(zhuǎn)基因研究。 利用北京油雞和白來航血液基因組DNA分別獲得了Mx基因的14個外顯子，與利用cDNA序列預(yù)測結(jié)果一致，其中編碼區(qū)包含13個外顯子，exon1為非編碼的。14個外顯子

5、大小分別為：48bp,329bp,193bp，138bp，155bp,139bp,199bp,79bp,123bp,142bp,159bp,77bp,243bp,463bp。 對北京油雞和白來航雞胚成纖維細胞進行誘導(dǎo)表達的研究時，發(fā)現(xiàn)不同濃度誘導(dǎo)劑(polyI：C)誘導(dǎo)時，白來航和北京油雞Mx蛋白基因表達在兩個不同的品種間存在明顯差異(半定量)，利用實時定量PCR(real-timePCR)對白來航Mx蛋白基因表達情況進行研究，

6、獲得的結(jié)果與半定量結(jié)果相同，具體機制需要研究探討。 通過對獲得的Mx蛋白基因在大腸桿菌中表達時稀有密碼子和mRNA翻譯起始區(qū)二級結(jié)構(gòu)的分析，構(gòu)建了四種重組表達菌。經(jīng)優(yōu)化稀有密碼子和翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)，在pETRTMx，pGEXRTMx重組表達菌中獲得了Mx蛋白基因的表達(75KDa)。實驗中首次獲得了表達雞Mx蛋白基因全編碼區(qū)ORF的重組菌。實驗結(jié)果也說明選擇合適的表達載體和宿主菌對外源基因的表達和獲得較高的表達量在原核表達選