長穗偃麥草中AP2-EREBP類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能驗證.pdf

1、干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫對植物的生長發(fā)育有重大的影響,是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的直接因為。這些逆境因子會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列生理生化變化以響應(yīng)外界環(huán)境的變化。轉(zhuǎn)錄因子是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白,通過它們與順式元件及其它相關(guān)蛋白之間的相互作用,可激活或抑制下游一系列功能基因的轉(zhuǎn)錄。植物中的AP2／EREBP類轉(zhuǎn)錄因子基因受到干旱、高鹽、低溫等逆境因子誘導(dǎo)會啟動下游一系列抗逆功能基因的表達(dá),對提

2、高植物的綜合抗逆性具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
　　 本研究利用同源序列克隆方法,結(jié)合RACE(rapid amplification of cDNA ends)和Genome Walking技術(shù),從抗逆性優(yōu)良的野生十倍體長穗偃麥草(Elytrigia elongata,2n=70)中克隆了AP2／EREBP家族的兩個逆境高豐度表達(dá)基因的全長cDNA,分別命名為EeAP2-1.1和EeAP2.2。序列分析表明,EeAP2-1.1

3、具有一個1179bp的開放閱讀框,編碼392個氨基酸殘基,含有一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域,屬于EREBP亞家族中的一個ERF轉(zhuǎn)錄因子基因。該基因編碼的氨基酸序列與大麥基因HvERF1(GenBank登錄號為ADO21119.1)編碼的氨基酸序列一致性為77％,與登錄號為EAZ09217.1,AAV98700.1,AAM00285.1的水稻基因編碼的氨基酸序列一致性分別為76％,76％和73％,與登錄號為ABO09809.1的甘蔗基因編碼的氨

4、基酸序列一致性為76％。EeAP2.2基因具有一個837bp的開放閱讀框,編碼278個氨基酸殘基,同樣含有一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域,是AP2大家族的又一個新成員。該基因編碼的氨基酸序列與普通小麥AP2家族同源基因TaDREB1和TaDREBW50(GenBank登錄號為AAL01124.1,AAY44604.1)編碼的氨基酸具有97％的序列一致性,與登錄號為AAY25517.1的大麥基因HvDREB1-a,登錄號為CAG30547.1的高

5、羊茅基因FaDREB2A及登錄號為AY064403的水稻OsDREB2.2基因編碼的氨基酸序列一致性分別為92％,85％,68％。說明該基因與小麥AP2家族基因的同源性最高。
　　 此外,本研究同時構(gòu)建了以CaMV35S啟動子驅(qū)動的含有EeAP2.2和.EeAP2-1.1基因的植物表達(dá)載體pBI121-EeAP2.2和pBI121-EeAP2-1.1。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤浸染法進(jìn)行了煙草轉(zhuǎn)化,目前已獲得了煙草T0代轉(zhuǎn)EeAP2.

6、2基因植株。通過Gus染色證明目的基因在煙草體內(nèi)獲得了表達(dá),通過酵母單雜交試驗驗證了EeAP2.2基因可以與DREB順式元件DRE結(jié)合,說明其為一DREB類轉(zhuǎn)錄因子。EeAP2.2和EeAP2-1.1的抗逆機(jī)理及小麥轉(zhuǎn)化試驗正在進(jìn)行中。
　　 本研究除從長穗偃麥草中獲得了兩個AP2／EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子基因EeAP2.2和EeAP2-1.1的全長cDNA序列外,也提供了一種快速、有效克隆同一家族功能基因的方法。為探討AP2／E