Fortilin和TAT融合蛋白在畢赤酵母的表達(dá)及對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的影響.pdf

1、對(duì)蝦病害在世界范圍的廣泛傳播,給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了重大損失。深入開展對(duì)蝦免疫機(jī)制研究并在此基礎(chǔ)上尋找對(duì)蝦疾病防治的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。Fortilin蛋白,一種多功能蛋白,具有參與細(xì)胞周期,鈣結(jié)合活性以及抗凋亡等多種活性。并且,對(duì)蝦fortilin蛋白參與抗病毒反應(yīng),對(duì)蝦注射重組fortilin后,進(jìn)行WSSV感染,存活率達(dá)80-100％,但是,口服重組fortilin組對(duì)蝦攻毒后存活率僅為10％。藥物注射費(fèi)時(shí)費(fèi)力,顯然不適用于大規(guī)模對(duì)

2、蝦養(yǎng)殖,那么如何提高口服效用,以方便的飼用方式應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)是亟待解決的問題。
　　 本研究從提高fortilin蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率入手,選用細(xì)胞穿膜肽引導(dǎo),試圖為其應(yīng)用尋找一種可行的方法。實(shí)驗(yàn)采用PCR方法構(gòu)建了fortilin和穿膜肽TAT的融合基因,在畢赤酵母中進(jìn)行融合蛋白的重組表達(dá),并在體外和體內(nèi)研究了融合蛋白對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫功能的影響。研究主要分為以下三個(gè)部分:
　　 1.首先,參照Genbank中基因序列設(shè)計(jì)引物

3、,PCR擴(kuò)增得到凡納濱對(duì)蝦fortilin目的基因片段。并且,直接在引物末端融合33個(gè)堿基對(duì)的TAT序列,通過PCR擴(kuò)增將TAT序列引入到基因的末端。同時(shí),以pTraccr-CMV2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到GFP基因片段。采用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建融合基因,Fortilin-GFP,GFP-Fortilin,TAT-Fortilin-GFP以及GFP-Fortilin-TAT用于后續(xù)穿膜研究;而Fortilin,TAT-Fortilin和F

4、ortilin-TAT用于后續(xù)免疫活性研究。為了進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒,在PCR擴(kuò)增時(shí)引入限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ識(shí)別位點(diǎn),基因片段經(jīng)雙酶切插入表達(dá)載體pGAPZaA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)Zeocin抗性篩選及測序分析,獲得重組表達(dá)載體,并確認(rèn)所得到的融合基因與設(shè)計(jì)的基因序列完全一致,讀碼框正確。重組質(zhì)粒經(jīng)AvrⅡ線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33,Zeocin抗性篩選及酵母基因組PCR檢測挑選陽性轉(zhuǎn)化子,酵母轉(zhuǎn)化子發(fā)酵后表達(dá)產(chǎn)物的上清液經(jīng)

5、SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜分析,均檢測到目的蛋白,表明在酵母中成功表達(dá)目的融合蛋白。
　　 2.為方便細(xì)胞定位觀察,本研究選擇綠色熒光蛋白(GFP)作為分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)利用GFP的自發(fā)熒光檢測融合蛋白的穿膜效果。實(shí)驗(yàn)中將融合蛋白與血細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示,培養(yǎng)30min,就可以檢測到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光,并且持續(xù)至24h,表明TAT有效攜帶fortilin穿透血細(xì)胞膜。并且,進(jìn)一步的離體翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TAT-Fortilin-GFP、G

6、RP-Fortilin-TAT可以穿透對(duì)蝦離體腸壁。同時(shí),TAT多肽融合于fortilin蛋白的C端和N端,均能促進(jìn)其穿透生物膜,穿膜效率未見明顯差異。
　　 TAT能夠促進(jìn)fortilin蛋白穿膜轉(zhuǎn)運(yùn),那么又會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生怎樣的影響呢?本實(shí)驗(yàn)選取了四種免疫相關(guān)酶指標(biāo),以體外原代培養(yǎng)的凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞來研究Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT重組蛋白的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Fortilin,TAT-F

7、ortilin和Fortilin-TAT顯著增強(qiáng)了血細(xì)胞酚氧化酶(PO)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P＜0.05),200、500μg/ml Fortilin,TAT-Fortilin和Fortilin-TAT處理組血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性顯著升高(P＜0.05),TAT-Fortilin和Fortilin-TAT融合蛋白顯著提高了血細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)活性,僅500μg/ml Fortilin處理組NOS活力顯著高于對(duì)照(P＜

8、0.05)。200μg/ml Forfilin-TAT處理組呼吸爆發(fā)和SOD活性顯著高于同濃度Fortilin處理組(P＜0.05);100、200μg/ml TAT-Fortilin和Fortilin-TAT處理組PO、NOS活性顯著高于同濃度Fortilin處理組(P＜0.05)。WSSV病毒刺激后,200μg/mlTAT-Fortilin和Fortilin-TAT處理組血細(xì)胞SOD活性,500μg/ml TAT-Fortilin處

9、理組血細(xì)胞PO活性,500μg/ml Fortilin-TAT處理組血細(xì)胞NOS活性顯著高于相同濃度TAT-Fortilin處理組血細(xì)胞相應(yīng)酶活(P＜0.05)。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,Fortilin能夠提高對(duì)蝦血細(xì)胞免疫活性,并且TFAT通過提高fortilin蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)而促進(jìn)其作用的發(fā)揮。
　　 3.以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,探討在基礎(chǔ)飼料中分別以酵母表達(dá)上清和酵母培養(yǎng)物兩種形式添加融合蛋白對(duì)對(duì)蝦生免疫及抗病力的影響。重組蛋白Fo

10、rtilin酵母表達(dá)上清添加組對(duì)蝦呼吸爆發(fā)、PO、NOS活性顯著升高(P＜0.05),同時(shí),Fortilin-TAT酵母表達(dá)上清添加組四種酶活均顯著增強(qiáng),且顯著高于Fortilin酵母表達(dá)上清添加組,結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測Fortilin蛋白能夠增強(qiáng)對(duì)蝦免疫力,TAT通過有效轉(zhuǎn)運(yùn)Fortilin蛋白從而加強(qiáng)這種免疫增強(qiáng)作用。除呼吸爆發(fā)活性外,TAT-Fortilin酵母表達(dá)上清添加組酶活顯著高于Fortilin酵母表達(dá)上清添加組,但其

11、SOD、NOS酶活顯著低于Fortilin-TAT。酵母表達(dá)上清添加組,這個(gè)結(jié)果表明TAT融合于蛋白C端更利于其作用的發(fā)揮。另外,酵母表達(dá)上清及相對(duì)應(yīng)的酵母培養(yǎng)物添加組之間酶活性基本無顯著差異,說明以酵母表達(dá)上清或者酵母培養(yǎng)物任一形式添加均可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白作用的發(fā)揮。病毒感染實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)基本與免疫酶活結(jié)果一致,飼料中添加重組蛋白Fortilin、TAT-Fortilin和Fortilin-TAT增強(qiáng)了對(duì)蝦的免疫力,從而提高了WSSV感染后

12、凡納濱對(duì)蝦存活率。Fortilin-TAT酵母表達(dá)上清添加組攻毒后存活率最高,TAT-Fortilill酵母表達(dá)上清添加組存活率次之,Fortilin酵母表達(dá)上清添加組存活率低于前兩組,但各組之間存活率沒有顯著差異(P＞0.05)?？召|(zhì)粒酵母添加同樣提高了對(duì)蝦病毒感染后的存活率,但差異不顯著(P＞0.05)。
　　 基于本文以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可以得出以下結(jié)論:TAT可以有效引導(dǎo)fortilin蛋白穿透生物膜,從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,進(jìn)