菌絲霉素在畢赤酵母中的分泌表達及其對大鼠腸道健康和免疫功能的影響.pdf

1、飼料中添加抗生素可促進動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率、對某些疾病起預防和治療作用，但抗生素的應用也帶來了耐藥性和殘留等負面效應，因此其替代品的研發(fā)成為目前的研究熱點。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽因其無耐藥性且具有良好的抑菌效果而逐漸受到人們的關(guān)注。菌絲霉素(Ple)是2005年Mygind等人從腐生子囊菌分泌蛋白中篩選分離得到的首例真菌防御素，具有強烈的抗革蘭氏陽性菌作用。但是由于從天然菌株中分離菌絲霉素工藝復雜，且成本較高，限制了其應用。為實現(xiàn)

2、菌絲霉素的廉價生產(chǎn)，本研究成功構(gòu)建了可分泌表達Ple的畢赤酵母基因工程菌，研究了重組表達產(chǎn)物的體外抑菌活性和穩(wěn)定性;在此基礎(chǔ)上初步評價其在動物試驗中的應用效果。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　試驗一:菌絲霉素多聚體基因在畢赤酵母中的表達
　　為提高Ple基因的表達量，降低其表達產(chǎn)物對宿主的毒性，本研究室在前期研究中構(gòu)建了Ple多聚體基因，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達。為進一步提高重組Ple表達水平，本試驗將Ple多聚體基因克隆進

3、入畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33后得到一株基因工程菌PPle;在1％甲醇誘導下，其表達產(chǎn)物Ple能夠有效分泌至培養(yǎng)基中，重組菌絲霉素分子大小約為41 kDa;在搖瓶中誘導，畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平達143μg/mL。該畢赤酵母工程菌的成功構(gòu)建為進一步評估其抑菌效果奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗二:重組菌絲霉素分離純化及體外抑菌活性研究
　　為了初步探討重組菌絲霉素的抑菌活性，將畢赤酵母基因工程菌

4、PPle在搖瓶中誘導的表達產(chǎn)物通過His標簽純化，并進行體外抑菌試驗。結(jié)果表明，本試驗獲得的重組菌絲霉素對豬鏈球菌和金黃葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有強烈的抑制作用;最小抑菌濃度顯示菌絲霉素對豬鏈球菌最為敏感，最小抑菌濃度為4μg/mL;重組菌絲霉素能從pH2.0到10.0保持抗菌活性，且經(jīng)胃蛋白酶消化處理后仍能保持較強的抑菌活性。上述研究結(jié)果表明，本實驗室研發(fā)的重組菌絲霉素抗菌肽具有較強的穩(wěn)定性，具有替代抗生素在動物生產(chǎn)上應用的潛力。

5、>　　試驗三:重組菌絲霉素抗菌肽對大鼠腸道健康和免疫功能的影響
　　為了考察重組Ple對大鼠腸道健康、免疫功能的影響，評估其在動物生產(chǎn)上的應用前景。本試驗采用2×3因子設(shè)計，60只4周齡健康SD大鼠，按體重相近、雌雄各半的原則，隨機分為6個處理(n=10)，單籠飼養(yǎng)。大鼠分別通過腹腔連續(xù)注射重組Ple、萬古霉素和培養(yǎng)上清液（對照）后。對其中一半大鼠進行金黃色葡萄球菌攻毒（另一半作為對照注射無菌生理鹽水），所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2周后宰殺

6、取樣。結(jié)果表明:金黃色葡萄球菌攻毒對大鼠免疫器官指數(shù)無顯著影響，但大鼠血清IgA和IgM含量有降低的趨勢(0.05＜P＜0.10)，腹腔注射菌絲霉素和萬古霉素均能提高大鼠血清免疫球蛋白含量，改善大鼠免疫機能;攻毒導致大鼠十二指腸絨毛高度下降、sIgA含量減少，盲腸金黃色葡萄球菌含量顯著增加（P＜0.05），但注射菌絲霉素可緩解上述負面影響，其效果優(yōu)于萬古霉素。
　　綜上所述，本研究成功實現(xiàn)了Ple多聚體基因在畢赤酵母中的分泌表達;