睡蓮花器官發(fā)育相關(guān)基因克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、睡蓮(Nymphaea spp.)又稱水百合，為睡蓮科睡蓮屬多年生宿根性水生植物，其花色艷麗，姿態(tài)優(yōu)美，又能凈化水體，具有很高的觀賞價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。同時(shí)，睡蓮位于現(xiàn)存被子植物系統(tǒng)樹的根部附近位置，被稱為ANITA(Amborella-Nymphaeales-Illiciales-Trime-Niaceae-Austrobaileya)類群的成員之一，這引起了植物系統(tǒng)進(jìn)化領(lǐng)域?qū)W者的研究興趣。而花是植物中包含進(jìn)化信息最多的器官，因此，對睡蓮

2、花器官發(fā)育的研究就顯得格外重要。但是，睡蓮花器官發(fā)育的研究剛剛起步，本研究在克隆兩個(gè)花器官發(fā)育關(guān)鍵基因的基礎(chǔ)上，通過其在擬南芥中超量表達(dá)研究其功能。此外，比較了6個(gè)花器官發(fā)育基因在兩份材料（正常睡蓮和一個(gè)萼片變成葉子的睡蓮）的花器官中表達(dá)水平的差異，主要結(jié)果如下:
　　 1.內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性評價(jià)
　　 以睡蓮‘黃公主’(Nymphaea‘Yellow Prince’)為植物材料，首先通過簡并PCR，亞克隆測序以及生物

3、信息學(xué)分析，獲得5條睡蓮內(nèi)參基因的mRNA序列。然后利用qRT-PCR技術(shù)結(jié)合生物學(xué)軟件（geNorm、NormFinder和Lin-RegPCR）評價(jià)了8個(gè)常用的內(nèi)參基因（在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜到3條睡蓮內(nèi)參基因序列）在睡蓮不同組織中以及激素處理和非生物脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。非生物脅迫包括低溫、高溫、鹽、干旱、重金屬脅迫等，不同組織包括萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、根、莖和葉，激素處理包括脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)和萘乙酸(NAA)處

4、理。我們將得到的熒光定量PCR數(shù)據(jù)分別用geNorm和NormFinder分析，以便篩選出合適的內(nèi)參基因。比較geNorm和NormFinder兩個(gè)軟件的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)軟件的分析結(jié)果基本相同，只是在不同處理的根中，出現(xiàn)了一些不一致。進(jìn)一步分析表明，這是由于UBQ11和UBC16存在基因共調(diào)節(jié)作用而引起的。綜合兩個(gè)軟件的分析結(jié)果表明，在涉及到多個(gè)處理和組織器官時(shí)，內(nèi)參基因AP47和ACT11表達(dá)最穩(wěn)定;在不同組織中，EF1a和ACT1

5、1最適合作內(nèi)參基因;AP47和ACT11在不同處理的根中表達(dá)最穩(wěn)定;而在不同處理下的葉片中，UBC16和ACT11作為內(nèi)參基因最為可靠。
　　 2.AGL6基因的克隆和功能分析
　　 根據(jù)AGL6同源基因在氨基酸序列上的保守性，設(shè)計(jì)簡并引物，以睡蓮‘黃公主’花蕾總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后亞克隆測序，得到了睡蓮AGL6基因的中間片段序列。然后再根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3'和5'RACE，最后將中間片段、3'

6、末端序列和5'末端序列拼接，得到基因全長。生物信息學(xué)分析表明該基因全長927bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼244個(gè)氨基酸，含有保守性很強(qiáng)的MADS結(jié)構(gòu)域和K-結(jié)構(gòu)域，屬于AGL6/AGL13亞家族，命名為NsAGL6。qRT-PCR分析表明該基因在所有組織器官中都有表達(dá)，在花瓣、萼片和莖尖中表達(dá)水平較高，在葉片和根中最低。瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NsAGL6編碼的蛋白定位在細(xì)胞核上，而酵母單雜交試驗(yàn)表明該基因編碼的蛋白單獨(dú)作用時(shí)，不具有

7、轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 為研究該基因功能，我們將基因的編碼框完整地插入到雙元載體1301-220中，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選，GUS染色，RT-PCR檢測，鑒定出23個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因T3代用于功能分析。我們發(fā)現(xiàn)，無論在長日照還是短日照條件下，轉(zhuǎn)基因植株的花期明顯提前，對6個(gè)擬南芥開花基因表達(dá)的定量分析表明，F(xiàn)T, LFY等多個(gè)開花促進(jìn)因子表達(dá)量上升，而負(fù)調(diào)節(jié)因子FLC表達(dá)量下降。

8、此外，NsAGL6超表達(dá)使擬南芥產(chǎn)生出更多的側(cè)生分枝，對擬南芥分枝相關(guān)基因的熒光定量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分生長素合成與運(yùn)輸相關(guān)的基因表達(dá)量下降，而且MAX1和MAX4表達(dá)量也下降，這暗示著分枝性的提高可能與生長素合成與運(yùn)輸受到影響有關(guān)，此外，與MAX調(diào)控途徑也有關(guān)。
　　 3.AP2基因的克隆和功能分析
　　 利用同樣的方法從睡蓮中分離出一個(gè)AP2同源基因NsAP2，全長1843bp，編碼450個(gè)氨基酸。序列比對表明該基因含有兩個(gè)

9、AP2/DREB結(jié)構(gòu)域（AP2/DREB Domain），系統(tǒng)發(fā)育分析顯示NsAP2屬于euAP2亞家族，且與銀杏、小買麻藤、云杉等較為原始的植物聚在一個(gè)分支，表明睡蓮在植物系統(tǒng)演化中的基礎(chǔ)地位。在自然生長的條件下，該基因在所有組織器官中都有表達(dá)，但是表達(dá)量不一，在花瓣、萼片中表達(dá)量最高，而在其他器官中，諸如莖尖、根、葉、雄蕊、心皮中表達(dá)量相差不是很大。RNA原位雜交試驗(yàn)表明，該基因在花芽分化進(jìn)程中的所有時(shí)期和區(qū)域都有表達(dá)，但在新分化的

10、器官原基中表達(dá)量比較高。瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NsAP2編碼的蛋白定位在細(xì)胞核上，而酵母單雜交試驗(yàn)表明該基因編碼的蛋白單獨(dú)作用，不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 同樣地，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選，GUS染色，RT-PCR檢測，鑒定出15個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因T3代用于功能分析。我們發(fā)現(xiàn)，在35S啟動子的驅(qū)動下，NsAP2在擬南芥中超表達(dá)不僅改變擬南芥生殖生長，而且改變擬南芥的營養(yǎng)生長。該基因的過量表達(dá)

11、使擬南芥花瓣增多，成了重瓣花，這是AP2基因超表達(dá)的典型性狀。此外，轉(zhuǎn)基因植株變高。經(jīng)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，赤霉素氧化酶基因GA2ox2和GA2ox7的表達(dá)量與野生型擬南芥相比，明顯下降，這可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥植株變高的原因。
　　 4.睡蓮花器官基因表達(dá)模式的研究
　　 我們得到一個(gè)睡蓮變異的材料—睡蓮‘蟹爪蘭’，其萼片變成葉片狀。通過石蠟切片發(fā)現(xiàn)‘蟹爪蘭’的萼片縱切面具有明顯的柵欄組織，該組織結(jié)構(gòu)一般只在葉片中才有。根

12、據(jù)6個(gè)花器官發(fā)育基因AGL6, AP2，AP3，PI, AG，SEP的序列（后4個(gè)基因序列來自NCBI）設(shè)計(jì)引物，利用qRT-PCR和半定量分析這6個(gè)基因在正常睡蓮和‘蟹爪蘭’花中的表達(dá)情況。因?yàn)樗徎ㄆ鞴俅嬖谶^渡類型，如瓣化的雄蕊，我們將睡蓮花器官從外到內(nèi)分為8輪。
　　 首先，對比6個(gè)基因在兩個(gè)材料中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AP2，AGL6在正常睡蓮萼片中表達(dá)量很高，但是這兩個(gè)基因在‘蟹爪蘭’的萼片中表達(dá)量在所有的花器官中最低，說明這兩

13、個(gè)基因可能行使A類基因功能。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在正常的睡蓮材料中，6個(gè)基因在所有的樣品中都有表達(dá)，并且表達(dá)量從外輪到內(nèi)輪呈現(xiàn)梯度變化，AP2和AGL6在外輪花被片中表達(dá)量很高，從外到內(nèi)，表達(dá)量逐漸降低;AP3和PI表達(dá)量從外輪花瓣到內(nèi)輪雄蕊，先下降，后上升，在內(nèi)輪雄蕊中表達(dá)量最高，在最外輪（萼片）和最內(nèi)輪（心皮）的表達(dá)量都比較低;AG基因的表達(dá)水平從外輪花被片到內(nèi)輪雄蕊，表達(dá)量逐漸上升，而在心皮中表達(dá)量偏低;SEP在所有的花器官中都有表