牡丹花器官發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá).pdf

1、牡丹（Paeonia suffruticosa）是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，也是我國(guó)的候選國(guó)花，具有極高的觀賞價(jià)值。利用基因工程技術(shù)培育花卉新品種，是世界花卉育種的研究熱點(diǎn)之一。迄今為止，盡管許多植物的花器官發(fā)育相關(guān)基因已被分離和克隆，但是關(guān)于牡丹的研究鮮有報(bào)道。
　　本研究以牡丹品種‘趙粉’為試材，通過同源克隆的辦法，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，分別從其萼片、花瓣、雄蕊和心皮中成功分離了牡丹PsAP1、PsAP2、PsPI、Ps

2、MADS1、PsMADS9、PsAG和PsMADS5這7個(gè)花器官形成相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，并通過相對(duì)熒光定量PCR的方法，對(duì)這些基因在不同器官及花芽分化過程中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析。同時(shí)，分別構(gòu)建了這7個(gè)基因的正義和反義植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，經(jīng)過RT-PCR后，得到部分陽(yáng)性植株，并對(duì)其表型初步進(jìn)行初步觀察。主要研究結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)已知基因的保守序列設(shè)計(jì)并引物，采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，首次從牡丹

3、品種‘趙粉’的萼片、花瓣、雄蕊和心皮中成功獲得了7個(gè)花器官發(fā)育相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，分別命名為PsAP1（GenBank登錄號(hào)：HM143943）、PsAP2(GenBank登錄號(hào): HQ222889)、PsPI(GenBank登錄號(hào): HQ878444)、PsMADS1(GenBank登錄號(hào):HQ222890)、PsMADS9(GenBank登錄號(hào):HQ902183)、PsAG(GenBank登錄號(hào):HQ222891)和PsMADS

4、5(GenBank登錄號(hào):HQ449569)。序列分析表明，除了PsAP2外，其余6個(gè)基因均含有MADS結(jié)構(gòu)域和植物所特有的K結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box基因家族。
　　2.采用相對(duì)熒光定量的方法對(duì)7個(gè)基因在牡丹不同器官中的表達(dá)差異進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同的基因在不同的器官中有不同的表達(dá)模式，具有一定的組織特異性。其中PsAP1主要在花瓣、萼片和心皮中表達(dá)，根和莖中幾乎沒有表達(dá)。PsAP2在各個(gè)器官中均有表達(dá)，在花瓣中最高。PsPI主要

5、在花瓣和雄蕊中表達(dá)，其他器官幾乎沒有表達(dá)。PsMADS1和PsMADS1主要在花瓣、雄蕊和心皮中表達(dá)，其他器官幾乎沒有表達(dá)。PsAG主要在雄蕊和心皮中表達(dá)，根和萼片中幾乎沒有表達(dá)。PsMADS5在各個(gè)器官中均有表達(dá)，心皮中表達(dá)量最高。
　　采用相對(duì)熒光定量的方法對(duì)這7個(gè)基因在牡丹花芽分化過程中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明：不同的基因在花芽分化過程中有不同的變化趨勢(shì)。其中PsAP1在花芽分化前期表達(dá)最高，后期表達(dá)最低。PsAP2在花

6、芽分化中期表達(dá)最高，初期表達(dá)最低。PsPI、PsMADS1和 PsMADS5在花芽分化過程中的相對(duì)表達(dá)量均為中期表達(dá)最高，初期表達(dá)最低。PsMADS9在花芽分化后期表達(dá)最高，初期表達(dá)最低。PsAG在花芽分化末期表達(dá)最高，初期表達(dá)最低。
　　3.成功構(gòu)建了 PsAP1、PsAP2、PsPI、PsMADS1、PsMADS9、PsAG和 PsMADS5的正義和反義植物表達(dá)載體，采用花序侵染法和葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，經(jīng)基因組PCR檢