qRT-PCR檢測馬立克氏病病毒gL、gI和meq基因mRNA方法的建立.pdf

1、馬立克氏病病毒I型(MDV-1)在雞體內(nèi)的感染分為四個期：早期溶細(xì)胞感染期(early cytolytic infection)、潛伏期(latency)、第二次溶細(xì)胞期（secondary cytolytic infection）和腫瘤形成期(development of tumors)。不同毒力MDV-1的潛伏期存在明顯差異，vMDV開始于6、7、8dpi，vvMDV開始于10-14dpi，而vv+MDV開始于14-16dpi。gL

2、和gI蛋白是MDV的兩種囊膜蛋白，在溶細(xì)胞期大量表達(dá)，而在潛伏期極少表達(dá)；meq(Marek'sEcoRI Q)是MDV-1特有的致瘤基因之一，主要在潛伏期表達(dá)。因此，gL、gI和meq基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平可以作為判斷MDV感染期的指標(biāo)。
　　 病毒編碼的microRNA(miRNA)于2004年被首次發(fā)現(xiàn)。MDV編碼的miRNA(mdv-miR)M4被證明與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系并能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；miR-6～miR-8則推測是

3、源于LAT的miRNA，可以下調(diào)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)，具有抗細(xì)胞凋亡的作用。這些研究成果證明，mdv-miRNA與腫瘤的發(fā)生存在著密切關(guān)系，腫瘤特異性和組織特異性的miRNA表達(dá)譜可作為細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要生物學(xué)指標(biāo)。為了研究不同毒力MDV編碼的miRNAs在感染的潛伏期(latency)的表達(dá)差異，課題試圖建立用于檢測MDV-lgL、gI和meq基因mRNA的熒光定量PCR(quantitative reverse-transcript

4、ase PCR，qRT-PCR)方法，為以這些基因在感染細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄水平作為為識別病毒溶細(xì)胞期和潛伏期的指標(biāo)提供工具。
　　 參照已發(fā)表的資料而設(shè)計的引物，以感染vvMDV廣西分離株YL040920的雞胚成纖維細(xì)胞單層(CEF)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出包含gL、gI、meq以及內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的長片段產(chǎn)物

5、，純化后連接pGM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆，增菌抽提質(zhì)粒。通過PCR和測序檢驗，證明已成功構(gòu)建pGM-T-gL、paM-T-gI、pGM-T-meq和pGM-T-GAPD，重組質(zhì)粒，可作為下一步構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線用的標(biāo)準(zhǔn)品使用。
　　 利用Primer6.0軟件，針對YL040920株的gL、gI、meq和GAPDH基因序列的保守區(qū)域設(shè)計了4對特異性引物，用于構(gòu)建qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測。以10倍梯度濃度的gL、

6、gI、meq和GAPDH基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板進(jìn)行SYBR Green I法qPCR反應(yīng)，建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其直線回歸方程。在該反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，4條標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度達(dá)到10-1000copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均超過0.98。結(jié)果表明，已成功建立了檢測MDV-1感染雞體內(nèi)基因gL、gI、meq和GAPDH基因mRNA的動態(tài)變化的qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。