茶樹不同逆境條件下QRT-PCR適宜內參基因的篩選.pdf

1、茶樹是我國重要的經(jīng)濟型作物，原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜暖喜濕的葉用木本植物。我國茶區(qū)分布較廣，地理范圍在18°～38°N，94°～122°E，氣候范圍南起熱帶季風氣候北至暖溫帶季風氣候;地形分布復雜，包括平原、丘陵、山地和高原。這些地區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)季節(jié)性干旱、低溫和重金屬等引起的非生物逆境與病、蟲害引起的生物逆境，從而造成春茶產(chǎn)量減少、品質下降和上市時間推后等問題，嚴重影響了春季名優(yōu)茶的生產(chǎn)和經(jīng)濟效益。僅靠栽培措施來解決茶樹逆境脅迫是不夠

2、的，抗逆育種已經(jīng)成為一種重要途徑?；诜肿铀缴系妮o助選擇正逐漸成為植物育種的有效工具，分離茶樹抗逆性基因，篩選到與抗逆性性狀緊密連鎖的分子標記，就可以用于對茶樹品種的抗逆性狀進行早期鑒定及抗逆性狀遺傳的穩(wěn)定性鑒定，這將大大縮短茶樹抗逆性育種的周期，降低選育難度。而在轉錄水平進行基因表達定量的方法，如實時定量PCR、RNA印跡、核糖核酸酶保護分析、基因芯片等，在蛋白質水平進行定量的方法如蛋白質印跡等，都需要應用內參基因(referenc

3、e gene)對目標基因表達量進行校正，以期獲得真實可靠的結果。
　　 本實驗利用同源克隆的方法克隆了茶樹相關內參基因的部分片段，使用QRT-PCR的技術建立各基因對應的實時定量方法，并進一步研究了干旱、鋁、冷、鹽、傷害等不同逆境處理下相關內參基因表達的穩(wěn)定性。具體研究結果如下:
　　 (1)利用同源克隆原理，以茶樹葉片cDNA為模板，獲得了7條內參基因（GAPDH、EF-1α、18S rRNA、TUA1、TUA2、AC

4、T、UBI）的中間片段，經(jīng)BLAST可知這7條基因與其他物種的同源基因具有高度相似性，堿基相似性均在80％以上，一方面說明實驗結果是準確的，同時也證明了內參基因的保守性，進一步驗證了其在分子生物學定量分析中的應用前景。
　　 (2)利用QRT-PCR技術，建立了7條基因對應的實時定量實驗方法。以10倍稀釋提純質粒為模板，所得到的標準曲線具有很高的敏感性及相關性，并且能在高通量范圍內顯示cDNA樣品的起始量。
　　 (3)

5、以不同脅迫處理下的定量cDNA為模板，利用QRT-PCR技術，對前章實驗中所得的7條內參基因的穩(wěn)定性進行分析。經(jīng)geNorm、BestKeeper及NormFinder三個生物學軟件計算得出結論，不同處理條件下，內參基因的表達穩(wěn)定性也不相同。結果表明在鋁脅迫處理條件下，18S rRNA表現(xiàn)出了相對最為穩(wěn)定的表達水平;冷脅迫下GAPDH與EF-1α都可應用于相關實驗;傷害處理條件下則是TUA1及GAPDH為最佳內參基因;干旱脅迫處理的最佳