甜櫻桃內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、甜櫻桃是果實(shí)成熟期最早的樹(shù)種之一，樹(shù)形美觀，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，管理用工少，生產(chǎn)成本低，經(jīng)濟(jì)效益極高，所以有著廣闊的發(fā)展前景。近年來(lái)，有關(guān)甜櫻桃的研究越來(lái)越多地采用分子生物學(xué)研究方法，而在進(jìn)行基因表達(dá)分析研究時(shí)，需要內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究以已發(fā)表的擬南芥的27個(gè)內(nèi)參基因做為候選，利用qRT-PCR方法分別對(duì)其在甜櫻桃品種艷陽(yáng)不同生長(zhǎng)時(shí)期的枝條、葉片和果實(shí)中的表達(dá)量，以及對(duì)內(nèi)參基因在干旱、鹽害、澇害、高

2、溫等逆境條件下植株葉片中的表達(dá)量進(jìn)行分析，利用GeNorm，BestKeeper和NormFinder軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以期為甜櫻桃的基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)研究提供合適的內(nèi)參基因。具體研究結(jié)果如下:
　　1、從模式植物中共選取了27對(duì)候選內(nèi)參基因，通過(guò)PCR檢測(cè)共從中篩選出TEF2、RPⅡ、18S、 GAPDH、 ACT、α-TUB、EF1-α-3、SAND-2、TUB、CYP2、RPL13共11個(gè)基因的引物能在甜櫻桃基

3、因組中擴(kuò)增到目的條帶，滿足內(nèi)參基因篩選的首要條件。
　　2、對(duì)提取RNA的常規(guī)CTAB法進(jìn)行縮短水浴的時(shí)間、延長(zhǎng)離心和沉淀的時(shí)間、增加抽提次數(shù)等措施進(jìn)行優(yōu)化，得到了完整性好，無(wú)降解，純度高的甜櫻桃各樣品RNA，28S和18S條帶分離清楚，條帶整齊無(wú)降解，能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。
　　3、在甜櫻桃營(yíng)養(yǎng)器官中，geNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)軟件的分析結(jié)果一致。geNorm的分析結(jié)果顯示內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性

4、排列順序?yàn)镾AND-2=RPL13＞α-TUB＞ CYP2＞ACT＞EF1-α-3＞TEF2＞RPⅡ＞TUB＞18S＞GAPDH，NormFinder的分析結(jié)果為:RPL13＞CYP2=EF1-α-3＞ACT＞TEF2＞α-TUB＞SAND-2＞RPⅡ＞TUB＞18S＞GAPDH。BestKeeper顯示最穩(wěn)定內(nèi)參基因的是18S和CYP2。結(jié)合三個(gè)軟件的分析，在甜櫻桃的營(yíng)養(yǎng)器官中，最適宜作為內(nèi)參的基因是CYP2。
　　4、在甜櫻桃

5、生殖器官中，geNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)軟件的結(jié)果不盡相同，geNorm分析顯示內(nèi)參基因的穩(wěn)定順序?yàn)門EF2=CYP2＞18S＞SAND-2＞ACT＞EF(1)-α-3＞α-TUB＞ RPL13＞ TUB＞ RPⅡ＞ GAPDH，NormFinder分析的結(jié)果為ACT＞ TUB＞ SAND-2＞α-TUB＞ CYP2＞EF1-α-3＞18S＞ TEF2＞RPⅡ＞ RPL13＞GAPDH。 BestKeep

6、er顯示較為穩(wěn)定的是18S和α-TUB。綜合比較分析，推薦SAND-2、CYP2和α-TUB作為內(nèi)參使用。
　　5、在甜櫻桃逆境處理中，geNorm和NormFinder的分析結(jié)果基本一致，BestKeeper的結(jié)果有所不同，geNorm分析顯示內(nèi)參基因的穩(wěn)定順序?yàn)?EF1-α-3=RPⅡ＞ CYP2＞TEF2＞18S＞ RPL13＞ ACT＞ TUB＞ GAPDH＞ SAND-2＞α-TUB。NormFinder的分析結(jié)果為18

7、S＞EF1-α-3＞CYP2＞RPⅡ＞RPL13＞TEF2＞ACT＞TUB＞GAPDH＞SAND-2＞α-TUB。BestKeeper軟件分析結(jié)果顯示，所有基因中表現(xiàn)較為穩(wěn)定的是18S和GAPDH。綜合考慮EF1-α-3、CYP2和RPⅡ?yàn)楸容^穩(wěn)定的內(nèi)參基因，推薦使用。
　　6、在甜櫻桃的所有樣品中，geNorm和NormFinder軟件的分析結(jié)果一致，geNorm顯示在所有的樣品中，表達(dá)的穩(wěn)定性排序?yàn)?TEF2=CYP2＞ EF