柑橘黃龍病菌三種分子檢測方法的比較及其與伴生細菌雙重定量PCR檢測體系構(gòu)建.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）又稱黃梢病、黃枯病、青果病，是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的一種系統(tǒng)性病害。迄今，HLB已危害到了亞洲、非洲、南美洲和北美洲的40多個國家的柑橘產(chǎn)業(yè)，在我國南方地區(qū)，柑橘黃龍病的蔓延甚至已經(jīng)導(dǎo)致部分地區(qū)柑橘產(chǎn)業(yè)的毀滅。HLB病原是一種專性寄生于韌皮部篩管細胞內(nèi)、難培養(yǎng)的革蘭氏陰性細菌，屬于變形菌門（Proteo-bacteria），α-變形菌綱（Alphaproteobacter

2、ial），韌皮部桿菌屬（Liberibacter）。柑橘黃龍病主要通過柑橘木虱和帶菌接穗苗木進行傳播，由于全球變暖，柑橘木虱分布范圍擴大，病發(fā)柑橘產(chǎn)區(qū)面積亦有擴大趨勢。柑橘黃龍病為積年流行病害，植株感病后潛伏期長，流行速度相當迅速，由此柑橘黃龍病的早期正確診斷對于病害的防治意義重大。
　　有關(guān)黃龍病的檢測診斷、檢測方法經(jīng)歷了從傳統(tǒng)生物學(xué)方法檢測到分子生物學(xué)檢測、從只能定性檢測到定性基礎(chǔ)上的定量檢測的發(fā)展過程。20世紀90年代后，隨

3、著PCR技術(shù)廣泛進入檢測檢驗領(lǐng)域，黃龍病由于難于獲得純培養(yǎng)，利用PCR方法檢測幾乎成為唯一通用的辦法，已經(jīng)有了利用常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR以及巢式 PCR檢測柑桔黃龍病菌的相關(guān)報道。本研究利用A.Hocquellet依據(jù)rplKAJL-rpoBC基因族序列所設(shè)計的能夠區(qū)別擴增柑橘黃龍病菌亞洲種和非洲種引物對A2和J5建立了新的巢式PCR檢測方法，并將該方法與目前較為通用的常規(guī)PCR方法和實時熒光定量PCR方法進行比較，分析比較常規(guī)

4、PCR、SYBR GreenⅠ熒光定量PCR和巢式PCR三種檢測體系對柑橘黃龍病菌檢測的特異性、靈敏性、準確性和實用性等各項參數(shù)；并采用巢式PCR和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR對廣西定點柑橘園疑似柑橘黃龍病樣品進行實際檢測，比較了兩種檢測體系的陽性檢出率。以期為柑橘黃龍病早期診斷、病原菌動態(tài)監(jiān)測的檢驗檢疫方法的選擇提供參數(shù)依據(jù)。
　　由于HLB病原菌為革蘭氏陰性難培養(yǎng)菌，尚無法人工分離培養(yǎng)，國內(nèi)外雖有少數(shù)幾則柑橘黃龍病菌體

5、外成功培養(yǎng)的相關(guān)報道，但并沒有獲得認同。目前的技術(shù)攻關(guān)主要集中于柑橘黃龍病菌與其寄主植物內(nèi)生菌的共培養(yǎng)，揭示黃龍病菌與內(nèi)生細菌之間的中相互作用，有利于黃龍病菌體外人工培養(yǎng)的研究。本研究從Genbank中篩選柑橘黃龍病罹病植株伴生細菌16S rRNA基因序列，進行生物信息學(xué)分析；并根據(jù)引物和探針的設(shè)計原則尋找不同細菌種屬間的保守片段，設(shè)計篩選適合實時熒光定量PCR檢測的細菌通用引物和能區(qū)分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的分型探針；構(gòu)建能夠有效

6、區(qū)分罹病柑橘樣品及混合培養(yǎng)體系中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的實時熒光定量PCR雙色檢測體系并優(yōu)化擴增條件，以期為柑橘黃龍病菌混合培養(yǎng)及黃龍病菌與寄主植物內(nèi)生菌之間的互作關(guān)系提供有效方法。
　　研究所獲得主要結(jié)果如下：
　?、俦狙芯坎捎媚軈^(qū)別性擴增柑橘黃龍病亞洲種和非洲種的A2/J5引物對為外側(cè)引物，CQULA03F/CQULA03R為內(nèi)側(cè)引物，構(gòu)建了柑橘黃龍病菌巢式 PCR檢測方法體系，體系靈敏度約為常規(guī)PCR的104倍可達

7、100ag·μL-1。
　　②對來自廣西合浦的425個疑似柑橘黃龍病樣品采用巢式 PCR和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法進行檢測，對疑似樣品的陽性檢出率分別為46.6％、40.0％，二者的符合度大于85.8%，說明巢式PCR可以有效檢測出田間的柑橘黃龍病，但靈敏度略低于SYBR GreenⅠ熒光定量PCR。
　?、鄹涕冱S龍病疑似樣品的監(jiān)測體系的靈敏性依次為SYBR GreenⅠ熒光定量PCR>巢式PCR>常規(guī)PCR

8、；巢式PCR由于有兩對引物進行兩次擴增反應(yīng)，特性優(yōu)于SYBR GreenⅠ熒光定量PCR和常規(guī)PCR。
　　④設(shè)計了用于實時熒光定量PCR檢測的細菌通用引物2對，篩選出1對適用于雙重定量PCR反應(yīng)細菌通用引物；設(shè)計了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的特異性探針各一對；選用黃龍病菌特異引物和特異探針各一對；優(yōu)化了檢測反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，構(gòu)建了監(jiān)測混合共培養(yǎng)體系中柑橘黃龍病菌和伴生菌、罹病柑橘植株內(nèi)柑橘黃龍病菌與共生細菌革蘭氏陽性菌或革蘭氏