飼料賴氨酸和精氨酸對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)影響及其拮抗作用機(jī)理研究.pdf

1、本論文研究了飼料中分別添加不同水平的賴氨酸和精氨酸對(duì)黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)幼魚(yú)生長(zhǎng)、飼料利用效率、體組成、相關(guān)酶的活性及血清生化指標(biāo)的影響，并由此得出黑鯛幼魚(yú)對(duì)飼料中賴氨酸及精氨酸的需要量；并通過(guò)研究精氨酸對(duì)組織中生長(zhǎng)相關(guān)主要基因表達(dá)來(lái)初步探討飼料必需氨基酸調(diào)控黑鯛生長(zhǎng)的主要機(jī)理。本論文還對(duì)飼料添加不平衡的精氨酸/賴氨酸對(duì)黑鯛幼魚(yú)的影響，兩種氨基酸在黑鯛體內(nèi)的拮抗作用及其可能的機(jī)理進(jìn)行探索。本論文的主要試

2、驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究結(jié)果如下。
　　 (1)室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)黑鯛幼魚(yú)(初重為9.13±0.09 g)8周來(lái)確定其對(duì)L-賴氨酸的需求量。設(shè)計(jì)6種等氮等能試驗(yàn)飼料，飼料必需氨基酸組成(除賴氨酸外)參照黑鯛魚(yú)體38％蛋白的氨基酸模式，賴氨酸以0.40％的添加梯度從2.08％逐步上升到4.05％。試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)飼料中的賴氨酸含量從2.08％上升至3.25％，黑鯛的增重率(WG)和特定生長(zhǎng)率(SGR)隨著飼料賴氨酸水平升高而升高(P<0.0

3、5)，當(dāng)飼料中賴氨酸含量為3.25％時(shí)，達(dá)到最大值(P<0.05)。飼料賴氨酸添加對(duì)飼料效率(FER)和蛋白質(zhì)效率(PER)也有促進(jìn)作用。賴氨酸對(duì)粗蛋白和總能的表觀消化率，以及消化器官中的蛋白酶和脂肪酶活性有顯著影響(P<0.05)。全魚(yú)和背肌蛋白含量隨飼料賴氨酸水平增加而增加，脂肪含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；各處理組之間的灰分和水分含量沒(méi)有顯著性差異(P<0.05)。在體必需氨基酸(EAAs)沉積方面，背肌中的Val和His，肝臟的Val、P

4、he、Met和Thr的含量不受飼料賴氨酸水平的影響(P>0.05)；其余的各種必需氨基酸含量均為先上升后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。黑鯛幼魚(yú)血清的甘油三酯、葡萄糖含量以及過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性均沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。血清總蛋白(TP)含量隨著飼料賴氨酸添加水平的增加而顯著增加。總膽固醇(T-CHO)含量則與TP含量的變化趨勢(shì)相反。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性隨著飼料賴氨酸含量的增加大致表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。隨著飼料

5、賴氨酸含量增加，血清游離賴氨酸濃度先顯著上升，在Diet4組到達(dá)最高值。
　　 使用二次曲線回歸模型，根據(jù)試驗(yàn)黑鯛幼魚(yú)的SGR同飼料中賴氨酸水平的相關(guān)性得出其賴氨酸需要量為3.32％，占飼料蛋白的8.64％。
　　 (2)室內(nèi)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)黑鯛幼魚(yú)(初重為10.51±0.15 g)8周來(lái)確定其對(duì)L-精氨酸的需求量。設(shè)計(jì)6種等氮等能試驗(yàn)飼料，精氨酸以0.30％的添加梯度從1.85％逐步上升到3.46％。試驗(yàn)結(jié)果顯示：六組

6、試驗(yàn)魚(yú)的存活率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。SGR先隨著飼料精氨酸的含量增加而顯著上升(P<0.05)，到2.51％精氨酸飼料組后，繼續(xù)增加飼料精氨酸含量并不會(huì)進(jìn)一步提高SGR(P>0.05)。Diet1組的FER顯著低于其它各組(P<0.05)；FER最高值(91.34％)出現(xiàn)在Diet5組，與Diet3，Diet4和Diet6組沒(méi)有顯著差異。PER和PPV的變化趨勢(shì)類似，均隨著飼料精氨酸水平先顯著上升，隨后保持穩(wěn)定。飼料粗脂肪的表

7、觀消化率不受飼料精氨酸添加水平的影響，干物質(zhì)，粗蛋白和總能的表觀消化率均有顯著變化。飼料精氨酸水平對(duì)黑鯛幼魚(yú)全魚(yú)和背肌的灰分和水分含量沒(méi)有明顯影響(P>0.05)。組織中蛋白含量隨著飼料精氨酸的添加水平增加而呈上升趨勢(shì)，而脂肪含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。除Thr之外，全魚(yú)體中的EAAs含量基本都隨著飼料精氨酸的含量增加而顯著上升，并在精氨酸添加水平較高的飼料處理組間保持穩(wěn)定；全魚(yú)精氨酸含量在Diet1組顯著低于其它各組(P<0.05)，此后全魚(yú)

8、精氨酸含量顯著遞增，在Diet5和Diet6組時(shí)，其含量則顯著高于之前四組(P<0.05)。肝臟Arginase活性在前三個(gè)飼料處理組呈上升趨勢(shì)(P<0.05)，此后繼續(xù)增加飼料精氨酸含量，不再顯著提高精氨酸酶活性(P>0.05)。Diet1組的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)活性顯著低于Diet5和Diet6組(P<0.05)。黑鯛幼魚(yú)血清中除T-CHO之外，其它指標(biāo)均受到飼料精氨酸水平的顯著影響。
　　 基于折線回歸模型模擬黑鯛幼魚(yú)S

9、GR與飼料精氨酸水平的關(guān)系可知，黑鯛幼魚(yú)最適精氨酸需求量為2.79％(占飼料)，相當(dāng)于占飼料蛋白的7.74％?；谝辉位貧w模型模擬黑鯛幼魚(yú)PER與飼料精氨酸水平的關(guān)系可知：當(dāng)PER達(dá)到最高值時(shí)，飼料精氨酸含量為3.09％，相當(dāng)于占飼料蛋白含量的8.13％。
　　 (3)配制添加外源精氨酸和賴氨酸的含量分別為0.9％和1.3％(占飼料干重)的基礎(chǔ)對(duì)照組飼料，使得兩種必需氨基酸含量符合之前兩個(gè)試驗(yàn)所得出的黑鯛最適需求量。在Die

10、t2和Diet3組飼料中，賴氨酸水平高于對(duì)照組賴氨酸含量的20％，而精氨酸水平則分別高于和低于對(duì)照組精氨酸含量的20％；在Diet4和Diet5組飼料中，賴氨酸水平低于對(duì)照組賴氨酸含量的20％，而精氨酸水平則同樣是分別高于和低于對(duì)照組精氨酸含量的20％；在Diet6、Diet7和Diet8的飼料中，精氨酸含量與對(duì)照組設(shè)計(jì)成相同水平，并以相比與對(duì)照組賴氨酸含量20％的比例，逐漸提高這三組飼料的賴氨酸含量。各組飼料通過(guò)調(diào)整甘氨酸和天冬氨酸的

11、含量保持等能等氮。8組飼料精氨酸/賴氨酸水平實(shí)測(cè)值分別為每100克飼料含2.83/3.25、3.46/4.06、2.27/4.08、3.51/2.70、2.31/2.74、2.87/4.03、2.91/4.68和2.85/5.24克。隨機(jī)投喂初重為10.03±0.13 g的黑鯛幼魚(yú)(每組三個(gè)重復(fù))，研究飼料不平衡精氨酸/賴氨酸添加對(duì)黑鯛的影響及探索是否存在拮抗作用。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料精氨酸/賴氨酸不平衡會(huì)嚴(yán)重影響黑鯛幼魚(yú)

12、的生長(zhǎng)性能及飼料利用等，相關(guān)指標(biāo)均在不同程度上低于飼喂對(duì)照組的試驗(yàn)魚(yú)。根據(jù)生長(zhǎng)表現(xiàn)、飼料利用效率、飼料賴氨酸與精氨酸的表觀消化率、魚(yú)體賴氨酸與精氨酸沉積量、肝臟精氨酸酶活性等指標(biāo)綜合判斷，黑鯛存在精氨酸-賴氨酸的拮抗作用；當(dāng)賴氨酸過(guò)量時(shí)，增加飼料中精氨酸含量可以一定程度緩解這種拮抗作用。
　　 (4)本試驗(yàn)以黑鯛肝臟和背肌組織總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA第一條鏈，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR反

13、應(yīng)。應(yīng)用NCBI上已有的魚(yú)類基因設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增黑鯛I(yíng)GF-I、IGF-IR和Arginase基因片段，其序列片段長(zhǎng)度分別為890bp、570bp和430 bp。根據(jù)BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明，上述三種基因均與其它魚(yú)類的相對(duì)應(yīng)基因具有較高的同源性和相似度，可以認(rèn)為是分別屬于各自的功能基因家族。
　　 (5)取試驗(yàn)二(精氨酸需求試驗(yàn))中的肝臟和背肌樣品分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：飼喂最低精氨酸水平飼料(Diet1)的黑鯛肝

14、臟IGF-I相對(duì)表達(dá)量顯著低于其它各組(P<0.05)，隨著精氨酸含量的增加，肝臟IGF-I的表達(dá)水平呈顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)添加的精氨酸含量超過(guò)3.25％之后，趨于穩(wěn)定(P>0.05)。當(dāng)投喂的飼料精氨酸水平超過(guò)2.88％時(shí)，背肌IGF-I表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。肝臟GHR mRNA水平隨著飼料精氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)。背肌IGF-IRmRNA的最低表達(dá)量出現(xiàn)在飼喂Diet1組飼

15、料的試驗(yàn)魚(yú)中(P<0.05)；而最高相對(duì)表達(dá)量則出現(xiàn)在Diet4組，顯著高于精氨酸添加量小于3.25％的試驗(yàn)組(P<0.05)，但與精氨酸添加量大于3.25％的試驗(yàn)組之間沒(méi)有明顯區(qū)別(P>0.05)。其它四個(gè)試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。飼料精氨酸水平對(duì)黑鯛肝臟精氨酸酶基因表達(dá)水平也有顯著影響。在Diet5和Diet6試驗(yàn)組檢測(cè)出相對(duì)較高的Arginase相對(duì)表達(dá)量，而表達(dá)量相對(duì)較低值則在Diet1和Diet2試驗(yàn)組出

16、現(xiàn)(P<0.05)
　　 取試驗(yàn)三(精氨酸/賴氨酸不平衡試驗(yàn))中的肝臟樣品分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)飼料精氨酸和賴氨酸添加量為適宜值時(shí)(Diet1)，肝臟的IGF-I mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著較高。在過(guò)量賴氨酸的飼料中增加精氨酸的水平(Diet2)，肝臟IGF-I的表達(dá)水平也顯著高于其它各組(P<0.05)，但與Diet1組差異不顯著(P<0.05)。飼料精氨酸和賴氨酸都不足量時(shí)(Diet5)，肝臟IGF-I表達(dá)量明顯減

17、少；而當(dāng)精氨酸含量一定時(shí)，飼料中過(guò)量添加賴氨酸，也會(huì)使得肝臟IGF-I呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。同樣的，相比于對(duì)照組(Diet1)，飼料中過(guò)量的賴氨酸添加量明顯抑制了肝臟Arginase基因的表達(dá)(Diet7和Diet8)；而降低飼料中的精氨酸含量，也會(huì)抑制Arginase基因的表達(dá)(Diet3和Diet5)。該基因的表達(dá)水平在飼喂Diet2、Diet4和Diet6組飼料的黑鯛幼魚(yú)之間沒(méi)有顯著差異，相比于對(duì)照組，差異也不顯著(P>0.05)。以上

18、結(jié)果表明，精氨酸對(duì)黑鯛的促生長(zhǎng)機(jī)理與其對(duì)生長(zhǎng)軸激素的轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控有關(guān)；飼料中精氨酸添加水平可以一定程度促進(jìn)精氨酸酶基因的表達(dá)，過(guò)量賴氨酸則對(duì)其起抑制作用。
　　 根據(jù)本研究的試驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論。
　　 1、黑鯛幼魚(yú)飼料需要添加適宜的賴氨酸和精氨酸來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)。
　　 2、本研究得到黑鯛幼魚(yú)飼料中最適賴氨酸和精氨酸需求量(以生長(zhǎng)表現(xiàn)評(píng)判)分別為：3.32％(占飼料比例)，相當(dāng)于8.64％(占飼料蛋白比例)；以