基于CRISPR-Cas9的水稻多基因編輯及其在育種中的應(yīng)用.pdf

1、隨著水稻基因組測序的完成，闡明水稻重要基因功能的研究也日漸迫切。利用ZFN、TALEN基因編輯技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了單個基因的定向敲除，但是對于家族基因的功能分析、基因之間的相互作用、多基因調(diào)控同一個復(fù)雜農(nóng)藝性狀的闡明則需要多基因突變體進行研究。雖然可以利用傳統(tǒng)的雜交方法獲得多基因突變體，但是品種間基因滲透和連鎖使得之后的篩選工作量加大。近年來發(fā)展起來的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能定向的突變基因，避免了傳統(tǒng)多突變體獲得過程中的基因連鎖和

2、基因滲透現(xiàn)象。因此，利用CRISPR/Cas9多基因編輯技術(shù)獲得多個基因共敲除突變體不僅對水稻基因功能研究有重大意義而且在水稻育種中有很大的應(yīng)用價值。
　　本研究在已有的CRISPR/Cas9系統(tǒng)上建立了水稻中CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)，并對該多基因敲除系統(tǒng)進行優(yōu)化，利用優(yōu)化過的多基因編輯系統(tǒng)進行水稻中多基因編輯實驗。主要研究結(jié)果如下:
　　一、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻單基因敲除
　　在前人CRISP

3、R/Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以單敲除水稻OsMKK4基因為例，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建雙元表達載體pC1300-Cas9-gMKK4，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將表達載體轉(zhuǎn)化中花11品種。T0代株系進行PCR擴增/酶切實驗，結(jié)果表明36株轉(zhuǎn)基因陽性株系中，有29株靶位點發(fā)生突變，突變效率為80.56‰其中19個株系為純合突變株;10個株系為雜合突變株。進一步測序結(jié)果表明，獲得的突變類型為堿基插入和堿基缺失，且大部分株系為移碼突變株。即

4、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中能高效的獲得單基因敲除突變體。
　　二、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻多基因敲除系統(tǒng)的建立
　　1.為了簡化sgRNAs組裝到pC1300-Cas9載體的步驟，我們在中間載體SK-gRNA多克隆位點1對(BamHⅠ和BglⅡ)同尾酶的基礎(chǔ)上引入另外兩對同尾酶(XbaⅠ和NheⅠ，XhoⅠ和SalⅠ)，命名為SK-4G。優(yōu)化過的系統(tǒng)能通過一個連接反應(yīng)同時將1-3個靶位點同時連入一個中間載

5、體SK-4G或者表達載體pC1300-Cas9。
　　2.利用優(yōu)化過的CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)將水稻3個基因(OsPDS、Os02923823和OsMPK2)的sgRNAs通過一輪克隆連入雙元表達載體中，并通過一個遺傳轉(zhuǎn)化實驗獲得110株T0代轉(zhuǎn)基因陽性株。
　　3.通過PCR擴增/酶切實驗和測序結(jié)果表明，共敲除的三個基因OsPDS、Os02923823和OsMPK2的突變效率分別為68.2％，66.4％和81.

6、0％。并且gRNA靶位點表現(xiàn)出堿基插入、堿基缺失和堿基序列微同源重組等不同的基因突變類型，說明不同的gRNA靶位點之間的突變是相互獨立的。本研究結(jié)果表明我們的CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)能快速、高效的獲得多基因敲除突變體。
　　三、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻8個基因的共敲除
　　1.為了驗證實驗室建立的CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)敲除基因的潛力，我們利用該系統(tǒng)構(gòu)建了共敲除水稻中8個農(nóng)藝性狀相關(guān)基因（3個

7、穗型基因DEP1，EP3和Gn1a、2個粒形基因GS3和GW2、一個株型基因LPA1、一個香味基因BADH2和一個生育期基因Hd1)的表達載體，命名為pC1300-Cas9-gDEP1-gGn1a-gGW2-gEP3-gBADH2-gLPA1-gGS3-gHd1。本實驗將sgRNAs與Cas9蛋白共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)，接著用PCR/RE的方法檢測8個基因的突變情況，結(jié)果表明8個基因在水稻原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)中都發(fā)生了基因突變，并且sg

8、RNAs串聯(lián)的個數(shù)并不影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的頻率，同時也從體外實驗證明了我們設(shè)計的靶序列能夠成功的指導(dǎo)Cas9蛋白發(fā)揮其切割DNA雙鏈的功能。
　　2.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將雙元表達載體轉(zhuǎn)化日本晴品種，T0代獲得36株轉(zhuǎn)基因陽性苗。測序結(jié)果表明，8個靶向基因EP3、GS3、GW2、BADH2、DEP1、Gn1a、LPA1和Hd1的突變頻率分別為50％、100％、67％、81％、83％、97％、67％和78％。進一

9、步分析每個靶向基因的基因型，我們發(fā)現(xiàn)了25種不同基因組合模式的多基因敲除突變體，甚至包括2株8基因共敲除純合突變株。說明優(yōu)化過的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中敲除效率高。
　　3.利用NCBI BLAST工具對8個靶序列進行特異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BADH2、DEP1和EP3基因有潛在的脫靶位點，且測序結(jié)果表明BADH2、DEP1和EP3基因的突變頻率分別為0％、11.1％和5.6％，說明該系統(tǒng)有較低的脫靶率。
　　4.通過

10、對T0代突變株的表型鑒定，發(fā)現(xiàn)除了未做處理的生育期基因，獲得的其他基因突變株的表型與預(yù)期符合。說明CRISPP/Cas9多基因編輯技術(shù)可以獲得背景一致的多達8基因共敲除的突變株。
　　四、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的水稻產(chǎn)量相關(guān)QTL的編輯
　　1.利用CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建共敲除水稻重要產(chǎn)量QTL基因GS3和Gn1a的表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將雙元表達載體轉(zhuǎn)化5個江浙地區(qū)廣泛種植的水稻栽培品種，南

11、粳9108、武運粳27、揚粳4227、浙粳22和浙粳88。對T0代株系靶位點測序分析，測序結(jié)果表明基因突變的類型主要有堿基插入和堿基缺失，由于GS3基因靶位點突變頻率達到100％，我們只獲得gs3單突突變體和gs3gn1a雙突突變體，并未獲得gn1a單突突變體。因此，在5個水稻品種中僅篩選出10個水稻株系(gs3-N9108和gs3gn1a-N9108，gs3-W27和gs3gn1a-W27,gs3-Y4227和gs3gn1a-Y422

12、7,gs3-Z22和gs3gn1a-Z22,gs3-Z88和gs3gn1a-Z88)。
　　2.轉(zhuǎn)基因T1代水稻株系產(chǎn)量性狀的調(diào)查結(jié)果表明在10個新株系材料中，其中有3個表現(xiàn)為單株產(chǎn)量增加，7個表現(xiàn)為單株產(chǎn)量降低，并且我們在T1代株系中成功分離出無選擇標(biāo)記基因的突變株系。水稻產(chǎn)量由有效穗數(shù)（或有效分蘗數(shù)）、每穗實粒數(shù)、千粒重和結(jié)實率四個因素所構(gòu)成。為解析QTL編輯導(dǎo)致產(chǎn)量變化的原因，我們將有效分蘗細(xì)分為有效大分蘗和有效小分蘗。進一