東農(nóng)冬麥1號抗寒性鑒定及CBF2基因克隆和表達分析.pdf

1、適應(yīng)高寒地區(qū)種植的冬小麥品種，其抗寒水平是最主要的適應(yīng)性狀之一。在培育強抗寒冬小麥品種的過程中，其變異材料的抗寒水平準(zhǔn)確鑒定為其育種進展的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。以往主要以田間自然越冬后的返青率為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，但由于自然條件年際之間的不穩(wěn)定性，常使育種材料的抗寒鑒定結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。目前，衡量冬小麥抗寒水平的通用方法是由逐漸降溫后分階段測定材料組織的相對電導(dǎo)率，模擬測定出其半致死溫度(即LT50)。但這種方法也常與品種實際的抗寒水平差距較大。研發(fā)冬

2、小麥育種材料抗寒水平鑒定的技術(shù)是冬小麥抗寒育種必須解決的主要問題。而冬小麥的抗寒遺傳基礎(chǔ)研究則是抗寒育種的另一主要方面，為其抗寒水平的遺傳改良提供基礎(chǔ)。
　　 本研究利用模擬冷凍處理評價冬小麥品種的抗寒性。以本實驗室于2007年通過審定并命名為東農(nóng)冬麥1號的高抗寒品種和不抗寒品種濟麥22為材料，以不同的冷凍條件鑒定品種抗寒性的水平，以期確定鑒定冬小麥品種最大抗寒力的冷凍程序。通過調(diào)查返青率和測定電導(dǎo)率的方法評價東農(nóng)冬麥1號的抗寒

3、性，并比較對兩個品種的抗寒性進行比較；大量的實驗研究表明，高抗寒植物品種之所以有較強的抗寒能力，通過CBF轉(zhuǎn)錄因子冷適應(yīng)途徑起著一定的作用，因此本研究還將利用高抗寒品種東農(nóng)冬麥1號克隆CBF家族及其相關(guān)基因，分別是CBF2(AY951945)、CBF4(AY951945)、CBF5(AY785902.1)、CBF9(AY785905.1)、CBF14(AY785901.1)、ICE41(EU562183.1)、ICE87(EU56218

4、4.1)進行克隆，并對克隆出的序列進行驗證，然后進一步利用實時熒光定量PCR技術(shù)對通過驗證的基因進行定量分析，從而了解在高抗寒品種東農(nóng)冬麥1號中CBF基因的表達情況。以上研究結(jié)果分別為：
　　 1)-12℃的低溫處理東農(nóng)冬麥1號24h以內(nèi)其返青率均在70％以上。
　　 2)通過對小麥葉片和葉鞘電導(dǎo)率的測定，我們發(fā)現(xiàn)在遭受冷害后葉片的電導(dǎo)率總是高于鞘，即葉片的受傷害程度總是高于葉鞘；葉片的受傷害程度與小麥的返青率相關(guān)性不大

5、，但是葉鞘是決定小麥返青率高低的重要部位。通過擬合Logistic方程求出東農(nóng)冬麥1號葉鞘的半致死溫度為-19.55℃。
　　 3)采用本試驗所設(shè)計的模擬冷凍條件可以準(zhǔn)確地鑒定冬小麥幼苗抗寒潛力。其抗寒鑒定的苗齡應(yīng)達3～5葉，冷凍試驗應(yīng)采用程序G。東農(nóng)冬麥1號經(jīng)程序G處理后，其半致死溫度(LT50)為-33℃；濟麥22的LT50為-16℃。
　　 4)在東農(nóng)冬麥1號中克隆得到的序列C2、C4、C5、C9、C14、I41和

6、I87。結(jié)果顯示，序列C2為CBF家族成員中的CBF2；C4、I41和I87序列分別確定是普通小麥3B染色體上的部分序列。序列C5與二粒小麥部分序列相似度達97%。序列C14與普通小麥Triticum aestivum cloneBAC1031P08相似度達100%。
　　 5)經(jīng)冷凍處理后，東農(nóng)冬麥1號中克隆得到的多個序列，其中之一為CBF2基因的片段，其長度為482bp，存在AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域和2段保守序列。該片段與一

7、粒小麥的COR/DREbindg fartor2(AY951945.1)、黑麥的CBFIVa-2B(ABY59787.1)和大麥的CBF2(ABE02653.1)相似度為100%、99%和100%。
　　 6)東農(nóng)冬麥1號葉片中CBF2在4℃處理4h開始明顯表達，6h時達到峰值，12h后最低；0℃作用2h，CBF2表達量最高，其他處理其表達量變化不大，而在3℃處理2h后溫度升至室溫后，其表達量略有升高；CBF2在東農(nóng)冬麥1號葉鞘