不結(jié)球白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系花蕾基因差異表達(dá)及不育相關(guān)基因的克隆.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(cytoplasmic male sterilit),CMS)是指不能產(chǎn)生有活力花粉,但植株形態(tài)正常的一種母性遺傳性狀。它是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ),同時(shí)又是研究核質(zhì)互作的理想模式系統(tǒng)。不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)原產(chǎn)中國,是我國南方普遍種植的大眾化的蔬菜,在蔬菜周年供應(yīng)中起著舉足輕重的作用。侯喜林等利用非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)獲得的不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系不僅

2、克服了OguCMS不育材料低溫黃化、無蜜腺的缺點(diǎn),而且不育率和不育度均達(dá)到100％,結(jié)實(shí)率與保持系無顯著差異,在生產(chǎn)上具有良好的應(yīng)用前景。本研究室還利用不結(jié)球白菜與甘藍(lán)型油菜Polima細(xì)胞質(zhì)雄性不育源進(jìn)行遠(yuǎn)源雜交和多代回交,成功地將不育細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到不結(jié)球白菜,獲得了異質(zhì)不結(jié)球白菜雄性不育材料。該不育系不育率較高,具有較好的產(chǎn)量、抗病性和配合力。因此對(duì)這兩種不育系進(jìn)行深入研究,具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究利用cDNA-AEL

3、P技術(shù)研究不結(jié)球白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系基因組的差異表達(dá),并對(duì)得到的差異片段進(jìn)行全長和表達(dá)分析,以期探討線粒體反向調(diào)控核基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和胞質(zhì)雄性不育機(jī)理,并為指導(dǎo)利用CMS進(jìn)行新品種選育提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.通過cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)Ogu和Pol不育系及其保持系花蕾進(jìn)行基因差異表達(dá)分析,得到了27條差異表達(dá)基因,其中共有17條在不育系中差異表達(dá),10條在保持系中差異表達(dá),這些基因分別參與了能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

4、、花器官發(fā)育、抗逆相關(guān)、代謝、轉(zhuǎn)錄等途徑。我們對(duì)其中BcCAM6、BcCoi1、BcTUB3三條基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證和表達(dá)量分析,結(jié)果表明BcCAM6在不育系花蕾中高表達(dá),而BcCoi1正好相反,我們推測BcCAM6與BcCoi1基因參與了雄性不育相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；而BcTUB3在雄蕊中積累,并且在不育系中下調(diào)表達(dá),推測其在雄蕊發(fā)育過程中起到重要作用。
　　 2.利用RACE技術(shù)成功克隆了一個(gè)在不結(jié)球白菜Ogu不育系中

5、特異表達(dá)的ANK基因的cDNA全長序列,命名為BcANK(GenBank登錄號(hào):GU288876)。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因包含ANK家族保守區(qū)域,與擬南芥錨定蛋白家族基因有95％同源性,二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,該蛋白含有較多的α螺旋,介導(dǎo)蛋白與蛋白間的相互作用。不同組織和不同小孢子發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,BcANK基因在不育系的雌蕊、雄蕊和花瓣等花器官中的表達(dá)水平顯著高于保持系；在小孢子發(fā)育的不同時(shí)期,該基因的表達(dá)水平在不育系

6、中顯著高于保持系,隨著小孢子母細(xì)胞的發(fā)育,該基因在不育系中一直維持較高的表達(dá)量。推測不育系花蕾在敗育過程中,由于線粒體功能變化而引起了一系列BcANK與的抗逆反應(yīng)、細(xì)胞程序死亡和發(fā)育調(diào)控等,說明BcANK在雄性不育中起到重要的作用。
　　 3.利用PCR技術(shù)成功克隆到一個(gè)在不結(jié)球白菜Ogu不育系中特異表達(dá)的ATPA基因DNA全長序列,命名為BcATPA。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因包含F(xiàn)1-ATP酶α亞基保守區(qū)域,并且含有ATP結(jié)合、wa

7、lker A modif和walker B modif,并含有跨膜區(qū)域。BcATPA與蕓薹屬中的芥菜、甘藍(lán)型油菜和擬南芥親緣關(guān)系最近,二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,該基因與ATP結(jié)合有關(guān)。不同組織和不同小孢子發(fā)育時(shí)期的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,BcATPA在不育系各個(gè)器官中的表達(dá)水平比保持系高；從整個(gè)小孢子發(fā)育來看,該基因從四分體時(shí)期開始在不育系的表達(dá)量顯著高于保持系,推測可能是線粒體基因Drf138和orfB共轉(zhuǎn)錄異常導(dǎo)致BcATPA異常