棉花細胞質雄性不育恢復基因的圖位克隆及PPR基因家族的分析.pdf

1、植物細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)是一種不能產生有活力花粉的遺傳現象，屬母性遺傳，在植物雜種優(yōu)勢利用中具有重要價值.利用胞質雄性不育系及恢復系和保持系的三系配套制種方式具有省工、方便、種子純度高、成本較低等優(yōu)點，將成為雜種棉商業(yè)化制種最有效的途徑之一。棉花不僅是世界上最重要的天然纖維和重要的油料作物，而且也是一種重要的生物能源。棉花雜種優(yōu)勢十分明顯，可有效提高產量、纖維品質與抗病、抗逆性

2、。棉花由于“三系”中的恢復系存在恢復力不強的缺陷使得棉花CMS的應用受到極大的限制，“三系法”制種仍未實現產業(yè)化。因此，克隆棉花細胞質雄性不育育性恢復基因對于研究細胞質雄性不育機理，培育優(yōu)良恢復系，更好的利用雜種優(yōu)勢具有重要的理論和實踐意義。
　　 目前已克隆的恢復基因中，除了玉米Rf2編碼乙醛脫氫酶外，矮牽牛Rf、蘿卜Rf0及水稻的Rf1a和Rf1b都編碼的是由PPR基序串聯組成的PPR蛋白PPR基因家族是近年來新發(fā)現的一個家

3、族，同時也是植物中最大的家族之一。它編碼一種以35個簡并氨基酸為重復單位串連排列組成的蛋白質，這些重復單元能形成一個超螺旋從而特異的與單鏈RNA結合。PPR蛋白在細胞器形成和植物發(fā)育的許多方面起著重要的調控作用。目前，在許多真核生物中都已經發(fā)現了PPR基因，但棉花上還沒有關于PPR基因的報道。
　　 本研究選用本室根據GenBank棉花EST數據庫中的序列開發(fā)設計的2803對EST-SSR引物采用基因型代表群分析法對親本不育系1

4、04-7A和恢復系0-613-2R及22株小群體進行篩選，將選中的6對引物對613株BC1群體進行擴增，共篩選到6個與Rf1基因緊密連鎖的分子標記。通過整合本室先前構建的Rf1遺傳圖譜上的原有標記，利用Joinmap3.0作圖軟件對恢復基因進行精細定位，整合后的圖譜含有18個標記（2個RAPD、3個STS標記和13個SSR標記），總遺傳距離為0.65cM.本研究所獲得的6個與Rf1緊密連鎖的EST-SSR標記（NAU2650、NAU29

5、24、NAU3205、NAU3652、NAU3938和NAU4040）表現為共分離，均與Rf1基因相距0.327cM，其中NAU3205為顯性標記，其它5個都是共顯性標記。
　　 利用6個與Rf1緊密連鎖的EST-SSR標記對本室構建的0-613-2R恢復系BAC文庫進行PCR篩選。先對二級混合克隆文庫進行PCR篩選，篩選到陽性混合克隆后，再對一級混合克隆庫進行篩選，最終得到陽性單克隆。6個EST-SSR標記共篩選到7個陽性BA

6、C單克隆，其中NAU4040未篩選到陽性克隆，NAU3938篩選到3個陽性克隆，其它標記各篩選到1個陽性克隆，NotI酶切檢測其插入片段大小范圍為105-130kb。將本室已獲得的與Rf1相關的克隆整合后在Rf1遺傳圖譜上的18對引物共獲得56個陽性BAC克隆.選取Rf1圖譜上兩側最近的13個標記所篩選到的31個陽性BAC進行HindⅢ酶切指紋分析，利用Image3.10b和FPCV7.2軟件對HindⅢ酶切圖譜進行分析后構建Rf1區(qū)域

7、的精細物理圖譜。
　　 利用蘿卜、矮牽牛和水稻恢復基因編碼的蛋白序列分別作為查詢探針對GenBank中棉花ESTs數據庫進行tblastn掃描，對獲得的所有ESTs利用CAP3軟件組裝并通過blastx預測每個contig的功能，獲得三個與蘿卜、矮牽牛和水稻恢復基因同源性較高的contigs。根據這三個contigs的序列設計特異引物對物理圖譜上的所有BAC進行篩選，其中根據contig2設計的引物篩選到一個克隆Y43。綜合物理

8、圖譜與同源序列分析的結果，將棉花Rf1基因定位在BACY43上并對該BAC全長測序。對獲得的BAC序列進行基因預測，共獲得24個ORF，其中4個ORF(ORF2、ORF3、ORF7和ORF18)編碼PPR蛋白并含有線粒體定位信號。通過4個ORF的序列比對及對恢復系和不育系的測序比較，推斷ORF3為Rf1基因候選ORF。
　　 為了了解陸地棉中PPR基因的分布和數量，本研究從147個陸地棉BAC中找到6個編碼PPR蛋白的ORF，同

9、時利用其它植物中已克隆的18個PPR基因編碼的蛋白作為tblastn比對的查詢探針，對GenBank中陸地棉EST數據庫進行掃描，通過CAP3組裝拼接鑒定出309個PPR unigene。為進一步研究陸地棉中PPR基因編碼的蛋白結構和表達特點，以陸地棉0-613-2R為材料通過RT-PCR的方法克隆了5個PPR基因的全長cDNA序列，分別將它們命名為GhPPR1-GhPPR5，對其基因組結構分析發(fā)現它們都不含有內含子，ORF長度從867

10、-1779 bp.結構域分析顯示這5個PPR基因編碼的氨基酸分別包含5-10個PPR重復單元，其中GhPPR1和GhPPR2屬于PLS亞家族，GhPPR3-GhPPR5屬于P亞家族，同時這5個基因與18個其它植物中的PPR基因的進化分析也顯示同一亞家族中的成員聚集在一起，本研究還利用實時熒光定量PCR對這5個PPR基因在陸地棉不同組織和器官中的表達進行了分析，結果顯示5個基因在根、莖、葉、花粉以及纖維中都表達，但在不同時期的相對表達量略

11、有不同。
　　 育性基因的分離克隆一直是人們關心的課題，它對于認識不育性機理，揭示生命現象以及更有效地利用雜種優(yōu)勢都有著十分重要的意義。本研究利用圖位克隆和同源序列克隆兩種方法相結合的策略，在構建Rf1精細遺傳圖譜和物理圖譜的基礎上，根據恢復基因同源序列設計引物對物理圖譜上的BAC克隆進行掃描，鑒定出包含Rf1基因的BAC克隆并對其全長測序，通過基因預測和特征分析及親本序列差異分析獲得了Rf1的候選ORF。棉花CMS育性恢復基因