櫛孔扇貝、海灣扇貝熱休克蛋白22基因的克隆和表達(dá)及其與櫛孔扇貝抗熱性狀相關(guān)SNP位點的篩查.pdf

1、本研究采取大規(guī)模EST測序方法，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，從櫛孔扇貝和海灣扇貝cDNA文庫中分離、克隆了熱休克蛋白22基因，并采用實時定量PCR技術(shù)檢測了HSP22基因的表達(dá)特征，并以克隆獲得的櫛孔扇貝HSP22基因為候選基因，研究了其多態(tài)性與櫛孔扇貝高溫抗性的關(guān)系。具體結(jié)果如下： 海灣扇貝熱休克蛋白22基因(AiHSP22)的cDNA全長為1112 bp，包含5’非翻譯區(qū)(UTR)51 bp，588 bp的開放閱讀框(OR

2、F)，473 bp的3'UTR，最后為22個腺嘌呤的Poly A尾巴。開放閱讀框編碼195個氨基酸的多肽，該多肽的估計分子量為22.71kD，估計的等電點為8.44。經(jīng)BLAST比對，AiHSP22與其他物種的HSP22蛋白有較高的相似性。SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)軟件分析，AiHSP22包含典型的小熱休克蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)：α-晶體球蛋白結(jié)構(gòu)域。利用Real-tim

3、e RT-PCR發(fā)現(xiàn)AiHSP22 mRNA在海灣扇貝體內(nèi)普遍存在于血細(xì)胞、肌肉、腎臟、性腺、鰓和心組織中，其中在心和肌肉的表達(dá)量最高，血細(xì)胞中表達(dá)量最低。同樣用實時定量PCR檢測海灣扇貝HSP22基因?qū)︺~、鉛和鎘三種重金屬刺激的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)AiHSP22 mRNA的表達(dá)量并未隨著三種重金屬濃度的提高而呈線性增加，且AiHSP22對鎘刺激的敏感性要遠(yuǎn)低于銅和鉛。研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)海灣扇貝HSP22作為一種監(jiān)測水體重金屬污染的生物標(biāo)記物提

4、供了借鑒。 櫛孔扇貝熱休克蛋白22基因(CfHSP22)的cDNA全長為1279 bp，包含5' UTR 122 bp，576 bp的開放閱讀框，3' UTR581 bp，最后是32個腺嘌呤的poly A尾巴。CfHSP22的開放閱讀框編碼191個氨基酸的多肽，該多肽的估計分子量為22.1kD，估計的等電點為9.69，經(jīng)BLAST比對，CfHSP22與AiHSP22的相似性達(dá)79％，與其他物種的HSP22也有較高相似性。SMAR

5、T軟件分析，CfHSP22也包含典型的小熱休克蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)：α-晶體球蛋白結(jié)構(gòu)域。利用Real-time RT-PCR，發(fā)現(xiàn)CfHSP22在各組織普遍存在，在肝胰腺中的表達(dá)最高，在血細(xì)胞中表達(dá)量最低。在鰻弧菌刺激下，櫛孔扇貝血細(xì)胞中HSP22 mRNA的表達(dá)量顯著升高，表達(dá)量隨時間的延長而增加，刺激后12小時達(dá)到最高值，隨后逐漸下降。結(jié)果表明櫛孔扇貝的熱休克蛋白22基因在機(jī)體抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。 根據(jù)30

6、℃高溫刺激下櫛孔扇貝的死亡情況篩選出了抗熱和熱敏感的扇貝群，通過不同扇貝CfHSP22基因的多態(tài)性分析，在其編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一個非同義突變的SNP位點：+94 C/A顛換。采用Bi-PASA PCR分析方法發(fā)現(xiàn)該位點出現(xiàn)三種基因型：野生型CC，雜合性CA和突變型CA，三種基因型與櫛孔扇貝抗熱性狀相關(guān)的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，+94AA基因型和+94CA基因型在抗熱群體中的頻率顯著高于敏感群體(P<0.05)，表明兩種基因型可能與櫛孔扇貝對高溫的抗性

7、相關(guān)。為驗證這一相關(guān)性，高溫刺激具有+94AA基因型、+94CA基因型和+94CC基因型的扇貝個體后進(jìn)行死亡率分析，結(jié)果顯示，具有+94AA基因型的扇貝死亡率極顯著低于+94CC基因型的扇貝(P<0.01)，具有+94CA基因型的扇貝死亡率顯著低于+94CC基因型的扇貝(P<0.05)。研究結(jié)果進(jìn)一步證實熱休克蛋白22基因+94 C/A顛換多態(tài)性與櫛孔扇貝對高溫的敏感性/抗性相關(guān)，為+94 C/A顛換作為一個潛在的分子標(biāo)記應(yīng)用于櫛孔扇貝