擬南芥抗灰葡萄孢毒素突變體篩選及其突變基因分析.pdf

1、灰葡萄孢是一種重要的植物病原真菌，常在蔬菜、水果、花卉上引致灰霉病，造成很大損失。毒素是灰葡萄孢重要的致病因子之一，但毒素與植物的互作機理尚不清楚。明確毒素作用方式，了解毒素作用機理，能為病菌致病機理的解析和抗病植株的培育提供依據(jù)。
　　 利用胚根生長抑制法和細胞膜透性改變法測定灰葡萄孢毒素對擬南芥的毒性作用。試驗菌株用改良FriesⅢ號培養(yǎng)液培養(yǎng)，用氯仿提取得到粗毒素。用毒素處理擬南芥種子，可抑制種子發(fā)芽和胚根生長，且毒素濃度

2、越高，抑制作用越強。毒素濃度為0.1％時，對種子發(fā)芽率沒有影響，但顯著抑制胚根生長，對胚根生長的抑制率為83％；當毒素濃度提高到0.2％時，種子發(fā)芽率減低，為97.2％，但胚根幾乎不能生長；當毒素濃度為0.3％時，被處理的擬南芥種子全部喪失發(fā)芽能力。細胞膜透性測定結果表明，毒素能使擬南芥葉片細胞的膜透性改變，胞內電解質滲漏。當毒素濃度為0.1％時，對葉片細胞膜有輕微的損傷作用，損傷率為8.31％；毒素濃度為0.8％時，損傷作用較為明顯，

3、損傷率為53.72％；當毒素濃度提高到1％時，對細胞損傷率達65.48％。
　　 根據(jù)實驗結果，建立了擬南芥對毒素敏感性的評價方法：采用胚根生長抑制法，毒素濃度為0.1％，擬南芥用MS培養(yǎng)基平板直立法培養(yǎng)，14d后測量胚根長度，計算胚根生長抑制率。
　　 擬南芥突變體庫由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所提供，共12100個株系。用毒素為選擇壓力篩選突變體庫，結果表明，大多數(shù)突變體對毒素非常敏感，在含毒素的培養(yǎng)基上不能發(fā)芽

4、。但是第96組AM-96突變體對灰葡萄孢毒素敏感性下降，其發(fā)芽率為100％，胚根長度為0.6cm，而無毒素培養(yǎng)基中野生型擬南芥胚根長度1.42cm，毒素對AM-96胚根生長的抑制率為58％。
　　 利用毒素處理AM-96葉片，其癥狀明顯輕于野生型葉片；接種病菌后，AM-96葉片僅出現(xiàn)輕微黃化，而野生型黃化嚴重且面積較大；從AM-96內能檢測到插入序列片段，而野生型中未能測出；AM-96回復突變的植株AMR-96，對毒素的敏感性增

5、加，與野生型植株相似，從其基因組中也未能檢測到插入序列。因此，外源序列插入位點基因與擬南芥對毒素的敏感性有關。
　　 用Tail-PCR法分析AM-96基因組插入片段側翼序列，并通過NCBI對其進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該位點為擬南芥相關驅動蛋白序列(kinesin motor protein-related，KMPR)。
　　 對該蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在十多種植物中發(fā)現(xiàn)存在該蛋白，重要的栽培植物有葡萄、水稻、大麥、玉米