球孢白僵菌抗逆相關(guān)功能基因克隆與基因工程菌株構(gòu)建研究.pdf

1、蟲(chóng)生真菌作為重要的天敵生物資源，具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是其可貴的流行潛力始終吸引著人們。球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下簡(jiǎn)稱白僵菌）是害蟲(chóng)微生物防治中一種經(jīng)典的絲孢類蟲(chóng)生真菌，可侵染15個(gè)目149個(gè)科的700多種昆蟲(chóng)和若干種蛛螨類。在自然界中它具有分布廣、感染力強(qiáng)和擴(kuò)散流行的特點(diǎn)；同時(shí)也具有不污染環(huán)境，易于培養(yǎng)，以及防治效果好等優(yōu)點(diǎn)。因此白僵菌也是研究最多、應(yīng)用最廣和最具有開(kāi)發(fā)潛力的蟲(chóng)生真菌。然而，如同其他真菌殺蟲(chóng)

2、劑一樣，球孢白僵菌因?yàn)閾舻购οx(chóng)時(shí)間長(zhǎng)、防效不穩(wěn)定以及自身抗逆性較差等缺點(diǎn)，目前在農(nóng)藥市場(chǎng)上的占有率依然很低。為延長(zhǎng)白僵菌孢子儲(chǔ)藏期，增強(qiáng)其環(huán)境穩(wěn)定性，有必要利用基因工程手段對(duì)其進(jìn)行改造，以獲得適合市場(chǎng)需要的產(chǎn)品，促進(jìn)其商品化生產(chǎn)和應(yīng)用。
　　 海藻糖是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的抗逆境劑，具有增強(qiáng)生物體對(duì)高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒物質(zhì)等逆境的抵抗能力。胞內(nèi)海藻糖積累與絲狀真菌孢子的儲(chǔ)藏期延長(zhǎng)密切相關(guān)。我們推測(cè)，通

3、過(guò)基因工程技術(shù)改變球孢白僵菌體內(nèi)海藻糖代謝途徑，可以提高孢子內(nèi)海藻糖含量，增加其抗逆能力。
　　 同樣，具有保護(hù)細(xì)胞功能的熱休克蛋白70是熱休克蛋白家族中最重要的一類家族成員。它的研究已成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。HSP70蛋白作為一種非特異性保護(hù)蛋白，能夠防止蛋白質(zhì)變性和幫助已變性的蛋白重新折疊，恢復(fù)正確的構(gòu)象，具有“分子伴侶”、細(xì)胞保護(hù)、抗凋亡等獨(dú)特復(fù)雜的生物學(xué)功能。因此，對(duì)于細(xì)胞的生存起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)克隆球

4、孢白僵菌hsp70基因，并深入探討其表達(dá)規(guī)律和作用機(jī)理對(duì)蟲(chóng)生真菌抗逆機(jī)制研究具有重要的意義。
　　 我們通過(guò)SMART RACE RT-PCR技術(shù)從球孢白僵菌Bb202菌株中克隆了海藻糖合成途徑中的兩個(gè)重要基因（海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因tps2）的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)分別為：FJ769373和FJ769375）。并通過(guò)DNA步移技術(shù)獲得了它們各自的上游啟動(dòng)子序列（GenBan

5、k登錄號(hào)：FJ769374，F(xiàn)J769376）。序列分析表明：球孢白僵菌tps1結(jié)構(gòu)基因含有一個(gè)長(zhǎng)度為55bp的內(nèi)含子，位于結(jié)構(gòu)基因的313堿基至367堿基處。其cDNA全序列為1906bp。開(kāi)放式閱讀框由1563個(gè)核苷酸組成，編碼520個(gè)氨基酸，成熟蛋白理論分子量為58.3kDa，理論等電點(diǎn)為5.63。5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）與3’-非翻譯區(qū)（3-UTR）分別為112bp和263bp。在終止密碼子下游3’-UTR有polyA加尾信

6、號(hào)AATATA和有26 bp的polyA結(jié)構(gòu)。球孢白僵菌tps1基因上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于第2785位G堿基處。該上游序列含有TATA-box、GC-box，同時(shí)也存在其它多個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如：Oct-1結(jié)合位點(diǎn)，CRE-BP結(jié)合位點(diǎn)，CdxA結(jié)合位點(diǎn)以及可與Ⅳ型鋅指蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合的GATA元件等。球孢白僵菌tps2結(jié)構(gòu)基因含有兩個(gè)長(zhǎng)度分別為140bp和62bp的內(nèi)含子。它們分別位于結(jié)構(gòu)基因的127堿基至266堿基處

7、和2209堿基至2270堿基處。它們均符合真核生物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)5’-GT…AG-3’規(guī)則。tps2的cDNA全序列為3219bp。開(kāi)放式閱讀框由2619個(gè)核苷酸組成，編碼872個(gè)氨基酸，成熟蛋白理論分子量為97.8kDa，理論等電點(diǎn)為6.32。5’非翻譯區(qū)（5'-UTR）與3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）分別為310bp和290bp。在終止密碼子下游含有28bp的polyA結(jié)構(gòu)。球孢白僵菌tps2基因上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于第4105

8、位C堿基處。該上游序列含有TATA-box、CAAT-box和GC-box，并且也存在其它多個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如：cap結(jié)合位點(diǎn)，Adf-1結(jié)合位點(diǎn)，Oct-1結(jié)合位點(diǎn)，C/EBP結(jié)合位點(diǎn)，CdxA結(jié)合位點(diǎn)等。其中可與Ⅳ型鋅指蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合的GXTA元件含量相當(dāng)高。
　　 使用同樣方法，我們從球孢白僵菌中克隆出了完整的熱休克蛋白HSP70基因編碼區(qū)序列及上游序列。該基因cDNA全長(zhǎng)2405bp，5’端非翻譯區(qū)17l

9、bp，3’端非翻譯區(qū)263bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）1971bp，編碼656個(gè)氨基酸。成熟蛋白理論分子量為71.3kDa，理論等電點(diǎn)為4.92。得到的上游序列長(zhǎng)度3559bp，其中有305bp序列與cDNA序列重疊。分析表明，該上游序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于第3255位G堿基處，沒(méi)有明顯的TATA-box和CAAT-box，但含有CCAAT-binding factor、GC-box等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，以及熱激應(yīng)答元件HSE和GATA

10、元件等啟動(dòng)子順式調(diào)控元件。
　　 通過(guò)Realtime-PCR技術(shù)，我們對(duì)球孢白僵菌tps1和hsp70基因在高溫、低溫、紫外照射等不同脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了檢測(cè)。從mRNA轉(zhuǎn)錄水平探討了不同脅迫條件對(duì)球孢白僵菌這兩個(gè)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，球孢白僵菌菌絲與孢子中的tps1基因在三種脅迫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異較小。而三種脅迫均能誘導(dǎo)球孢白僵菌熱休克蛋白基因hsp70的快速高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)。說(shuō)明球孢白僵菌中tps1與hsp70基因，對(duì)于

11、外界逆境影響，具有不同的應(yīng)答機(jī)制。
　　 將克隆得到的球孢白僵菌tps1基因連接到分泌性表達(dá)載體pVIC9K上后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)獲得了60kDa左右的表達(dá)蛋白，與預(yù)測(cè)的結(jié)果（58.3kDa）及相關(guān)報(bào)道結(jié)果接近。同時(shí)，酶活測(cè)定結(jié)果表明，表達(dá)蛋白具有海藻糖-6-磷酸合成酶生物活性，誘導(dǎo)的粗酶液酶活最高達(dá)到1.384U/ml。
　　 將克隆得到的球孢白僵菌tps1基因連接到含有構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘

12、油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的載體pBARGPE1后，通過(guò)芽孢轉(zhuǎn)化，重新轉(zhuǎn)入球孢白僵菌中，對(duì)該基因進(jìn)行組成型表達(dá)?？鼓嫘栽u(píng)價(jià)表明tps1基因的組成型表達(dá)，在低溫下可一定程度增強(qiáng)重組菌株的貯藏性能，相對(duì)于出發(fā)菌株，重組菌株的活孢率同比提高了約35％。在一定熱脅迫范圍內(nèi)，重組菌株耐熱性能也得到了提高，相對(duì)于出發(fā)菌株，重組菌株的活孢率同比提高了約30％。但重組菌株抗紫外能力并沒(méi)有增強(qiáng)。生物學(xué)特性觀測(cè)表明，重組工程菌株相對(duì)于出發(fā)菌落生長(zhǎng)較慢，且產(chǎn)孢量降