稻曲病菌的分離及其多樣性分析.pdf

1、稻曲病是一種水稻穗部病害，由稻曲病菌Ustilaginodea Wrens(Cooke)Takahashi在水稻穗部為害產(chǎn)生稻曲球。稻曲病過去僅在中晚稻田中零星發(fā)生，20世紀(jì)80年代以來，隨著直立型和密穗型高產(chǎn)水稻品種大力推廣及農(nóng)田肥力的提高，稻曲病的發(fā)生日益嚴(yán)重。稻曲病不僅影響稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且產(chǎn)生稻曲病菌毒素，對(duì)人和動(dòng)植物都有毒性，目前已經(jīng)上升為水稻產(chǎn)區(qū)的主要病害之一。
　　 一般認(rèn)為厚垣孢子是稻曲病主要的初侵染源，在水

2、稻開花前后從穗部進(jìn)行侵染：但也有人猜測(cè)稻曲病是系統(tǒng)侵染病害。長(zhǎng)期以來，由于稻曲病菌的人工接種成功率極其低下，從而制約了稻曲病菌的侵染途徑與發(fā)育方式的研究。一個(gè)行之有效的接種方法一直是稻曲病研究的瓶頸問題。
　　 本研究主要包括稻曲病菌分離方法的比較研究、稻曲病菌無(wú)性孢子形成過程及厚垣孢子萌發(fā)率測(cè)定、中國(guó)不同地理來源稻曲病菌rDNA-ITS的分析和中國(guó)不同地理來源稻曲病菌rDNA-IGS的分析4個(gè)內(nèi)容。
　　 1.本文對(duì)不

3、同情況下稻曲病菌的分離方法進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明成熟早期稻曲球上的絕大多數(shù)新鮮的厚垣孢子具有萌發(fā)能力，及時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)是病原菌成功分離的關(guān)鍵。隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，厚垣孢子萌發(fā)能力急劇下降；消毒處理可殺死大部分的厚垣孢子。菌核可長(zhǎng)期保存并保持極高的萌發(fā)生長(zhǎng)能力，是稻曲病菌分離最為理想的材料。稻曲球中部的致密菌絲組織分離難度較大，只能作為稻曲病菌分離的一種補(bǔ)救方法。
　　 2.分離得到的稻曲病菌在PSA培養(yǎng)基上26℃黑暗條件下人工培

4、養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時(shí)期的菌落上取樣，進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的第7天，菌落表面上部分菌絲開始糾結(jié)，形成初期的集結(jié)狀菌絲結(jié)構(gòu)；第14天，集結(jié)狀菌絲結(jié)構(gòu)體積增大，數(shù)量增多，其上丌始產(chǎn)生大量分生孢子；一些分散的菌絲上也可產(chǎn)生少量的分生孢子。第2l天，菌落表面產(chǎn)生黃色子實(shí)體，子實(shí)體的外層是一層菌絲，內(nèi)部集生大量厚垣孢子。第30天，黃色子實(shí)體體積進(jìn)一步增大，數(shù)量增多，早期形成的子實(shí)體開始成熟，并從頂端或一側(cè)破裂，散出厚垣孢子。厚垣孢子形成后

5、，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)率急劇下降。
　　 3.利用ITS4、ITS5擴(kuò)增稻曲病菌的rDNA-ITS片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶為650bp左右。測(cè)序分析結(jié)果表明，我國(guó)不同地區(qū)35個(gè)菌系的rDNA-ITS序列完全一致，即同源性為100％。這說明我國(guó)不同生態(tài)區(qū)的稻曲病菌具有高度同源性，其ITS具有高度保守性。將獲得序列與Genbank中的rDNA-ITS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，這些序列和Genbank中的ABll6645、ABl05

6、954同源性為100％。這說明我國(guó)的稻曲病菌和日本的稻曲病菌也具有高度同源性。
　　 4.設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增稻曲病菌rDNA-IGS區(qū)全長(zhǎng)的引物UIGSI和UIGSⅡ。利用引物UIGSI和UIGSⅡ?qū)Σ糠值厩【档膔DNA-IGS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，然后克隆、測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，稻曲病菌的rDNA-IGS區(qū)包括中間易變區(qū)和兩邊的保守區(qū)。這些菌系兩邊的保守區(qū)序列相似值達(dá)到99.44％。中間的易變區(qū)含有一個(gè)77bp的重復(fù)單元，重復(fù)單元重

7、復(fù)次數(shù)的不同導(dǎo)致了不同菌系具有不同的長(zhǎng)度多態(tài)性。為了更直觀的檢測(cè)rDNA-IGS的長(zhǎng)度多態(tài)性，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)其中間易變區(qū)的PCR擴(kuò)增引物UIGSⅢ和UIGSⅣ，能夠更清楚的顯示不同菌株rDNA-IGS的長(zhǎng)度多態(tài)性。
　　 利用引物UIGSⅢ和UIGSⅣ對(duì)35個(gè)稻曲病菌菌系進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，共檢測(cè)到4中多態(tài)性類型。具有長(zhǎng)度多態(tài)性的菌系比例較低，這進(jìn)一步證明了稻曲病菌遺傳穩(wěn)定和一致性。多態(tài)性類型和菌系的地理來源沒有明顯關(guān)系。但不同地