一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌的鑒定、酶的性質(zhì)及其基因的克隆與表達.pdf

1、幾丁質(zhì)酶(chitinase Ec.3.2.14)能夠催化幾丁質(zhì)水解為幾丁寡糖和 N-乙酰氨基葡萄糖，廣泛存在于各種微生物、植物及動物細胞和組織中， 參與多種生理過程。由于幾丁質(zhì)酶在生物防治和處理幾丁質(zhì)廢物等方面 具有巨大的應用潛力，因而受到廣泛的重視。 為了充分利用產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物在生物防治中的潛力，作者用蛆蠅源幾丁質(zhì)作為篩選培養(yǎng)基，從土壤中初篩到51株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物，并通過生物測定法，復篩到一株對蝗蟲有較高致死率的細

2、菌C4。此外，通過觀察蝗蟲的中腸組織切片進行了初步的組織病理學研究。研究發(fā)現(xiàn)在 飼喂經(jīng)幾丁質(zhì)誘導的C4菌液12小時后，蝗蟲的中腸圍食膜基本被破壞；在48小時后，中腸組織出現(xiàn)明顯的組織病理癥狀。為確定該菌的分類地位，對細菌C4進行了形態(tài)學觀察、生理生化指標測定及分子生物學鑒定。16S rDNA序列分析顯示該菌與Sanguibacter，Oerskovia和Cellulomonas 三個屬有較高的序列同源性，同源性分別為95.2-96.

3、1％、95.4％和93.6-95.2％。結合表型特征和16S rDNA序列分析，細菌C4最接近 Sanguibactet屬，因此初步將其歸為Sanguibacter屬，命名為Sanguibacter sp.C4。分別將經(jīng)幾丁質(zhì)誘導的C4菌液(酶活力：1.16 U／mL)和未誘導的菌液飼喂蝗蟲，誘導組蝗蟲的死亡率(61.1％)明顯高于未誘導組(35.6％)，表明細菌C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶與其對蝗蟲的致病力呈顯著正相關性。 為了提高細菌

4、C4幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量，本文系統(tǒng)研究了碳源，氮源，起始pH值、培養(yǎng)基裝量、培養(yǎng)溫度和時間等因素對細菌C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響。結果表明，碳、氮源分別以膠體幾丁質(zhì)、KN0<,3>和蛋白胨較好。在起始pH值7.6．8.5，培養(yǎng)基裝量為三角瓶體積的12％，培養(yǎng)溫度28℃，振蕩培養(yǎng)(180 r／min)5 d時最有利于幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生。在此基礎上采用均勻設計法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基配方。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：膠體幾丁質(zhì)1.5％，蛋白胨0.55％，KN0<,3>

5、 O.3％，MgS0<,4> 0.09％，Tween800.005％。在該條件下，幾丁質(zhì)酶活力達2.68 U／mI，比在原基礎培養(yǎng)條件下的酶活力提高90.1％。 為了進一步研究細菌C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)，作者通過硫酸銨沉淀，離子交換和凝膠過濾色譜對該酶進行了純化。研究表明細菌C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶以單體形式存在，分子量為57-58.8 kDa，等電點4.2。最優(yōu)的pH值和反應溫度分別為4.6和37℃，并在pH,值3.0至8.O范圍內(nèi)保持穩(wěn)

6、定。此外，該酶在50℃作用30 min后，可保持75％以上的活性，在60℃作用30 min后，可保持50％左右的活性。Mn<'2+>對酶活性有輕微促進作用，而Fe<'2+>則強烈抑制酶活性。該幾丁質(zhì)酶的Km值和Vmax分別為6.95 mg／ml和10.53U／min·mg。為確定該酶的類型，作者通過薄層層析結合質(zhì)譜分析對水解產(chǎn)物進行測定，結果表明該酶主要將膠體幾丁質(zhì)分解為幾丁二糖，及少量的N一乙酰氨基葡萄糖，不能分解幾丁二糖的類似人工合

7、成底物pNP-GlcNAc，因此推斷此酶為一種具有一定內(nèi)切酶活性的幾丁二糖酶。將不同濃度的幾丁質(zhì)酶與沙雷氏菌HR-3(一株蝗蟲致病菌)的菌液混合后飼喂蝗蟲。結果顯示添加幾丁質(zhì)酶后，蝗蟲死亡率均明顯高于未加酶組，表明細菌C4幾丁質(zhì)酶對沙雷氏菌HR-3滅蝗具有增效作用。 克隆細菌-C4產(chǎn)幾丁質(zhì)酶基因并在大腸桿菌中高效表達對于從分子生物學水平上研究該幾丁質(zhì)酶及進一步進行大量生產(chǎn)都是非常必要的。在本研究中，作者首先通過幾丁質(zhì)酶基因的特異

8、性PCR引物從細菌C4基因組中擴增到幾丁質(zhì)酶基因片斷(chM-F)。將chiA-F序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，結果顯示該序列與數(shù)據(jù)庫中已有的沙雷氏菌屬(Serratia)、伯克霍爾德屬(Burkholderia)和腸桿菌屬(Enterobacter)中分離的幾丁質(zhì)酶基因有很高的同源性(93.1-99.6％)，表明在C4基因組中可能有相似類型的幾丁質(zhì)酶基因。通過比對分析從GenBank中獲得的高同源性序列的保守區(qū)域設計2對

9、PCR引物進行嵌套PCR，擴增出幾丁質(zhì)酶Chi58基因的開放閱讀框(ORF)。該ORF序列由1692個核苷酸組成，編碼563個氨基酸，在N端有23個氨基酸的信號肽，成熟蛋白的分子量應為58，544 Da。通過保守域分析，Chi58有兩個保守結構域：—個ChiN結構域和一個18家族糖苷酶催化域。同源性分析表明Chi58的蛋白質(zhì)序列與沙雷氏菌屬、伯克霍爾德屬和腸桿菌屬中幾丁質(zhì)酶的同源性為88.9-99.6％。將Chi58基因克隆到pET32