棉花纖維發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析和兩個(gè)基因的克隆與初步功能分析.pdf

1、棉花纖維是紡織工業(yè)的重要原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。纖維的發(fā)育從胚珠表皮細(xì)胞的分化和突起開(kāi)始，并決定纖維的最終品質(zhì)和產(chǎn)量。因此從分子水平闡明棉纖維初始發(fā)育的機(jī)理以及影響纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的主要因素，具有重要的理論價(jià)值與現(xiàn)實(shí)意義。本研究選用3個(gè)無(wú)絨無(wú)絮突變體(XZ142 FLM、MD17、SL1-7-1)、2個(gè)無(wú)絨有絮突變體(N1N1、n2n2)和超短纖維突變體(Li1li1)進(jìn)行棉花纖維初始發(fā)育和伸長(zhǎng)發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析，并和葉片

2、表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比較，克隆1個(gè)負(fù)向調(diào)控的R3-MYB基因GhCPC和1個(gè)與細(xì)胞骨架相關(guān)的基因GhDIS2，初步闡述該基因的功能。
　　 1、棉花纖維和葉片轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析
　　 轉(zhuǎn)錄因子也稱(chēng)為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用并對(duì)轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白。本研究對(duì)棉屬編碼GL1、GL2、GL3、WD40的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行表達(dá)分析。這些轉(zhuǎn)錄因子包括了編碼WD40的GhTTG1

3、、GhTTG2、GhTTG3、GhTTG4,編碼GL2的GhDEL61、GhDEL65，編碼GL3的GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3，編碼GL1的GhMYB2、GhMYB25、GhMYB109及其他MYB基因。
　　 掃描電鏡觀察突變體1 DPA胚珠表面，無(wú)絨無(wú)絮突變體表面光滑無(wú)突起細(xì)胞，2個(gè)無(wú)絨有絮突變體的纖維突起數(shù)量明顯少于野生型。從野生型和無(wú)絨無(wú)絮突變體的-3、0、1 DPA胚珠的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG1、G

4、hTTG3、GhDEL61、 GhDEL65、GhMYB25等轉(zhuǎn)錄因子在不同時(shí)期的有纖維材料中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。從野生型和無(wú)絨有絮突變體的1、3、5 DPA胚珠和纖維混合物的基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG3、GhTTG4、GhDEL61、GhMYB8等多個(gè)基因在無(wú)絨有絮突變體中低表達(dá)。
　　 超短纖維突變體(Li1li1)表現(xiàn)為纖維伸長(zhǎng)停止，是研究纖維伸長(zhǎng)發(fā)育早期的優(yōu)異種質(zhì)資源。從野生型和超短纖維突變體的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GhTTG1

5、、GhDEL61、GhDEL65、GhMYB25、GhMYB38、G042C02A等轉(zhuǎn)錄因子在4 DPA野生纖維材料中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。其中，G042C02A是本實(shí)驗(yàn)室7235 cDNA文庫(kù)中一個(gè)克隆，是新的棉屬轉(zhuǎn)錄因子。
　　 掃描電鏡觀察陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和密生絨毛品系T586功能葉正面，T586葉正表面密布絨毛，而TM-1葉表面僅有球狀突起。選用這兩個(gè)材料分析轉(zhuǎn)錄因子在成熟葉片中的差異表達(dá)，GhMYB25、 GhDEL61在

6、T586中高表達(dá)。
　　 2、棉纖維發(fā)育負(fù)向調(diào)控因子GhCPC的克隆與鑒定
　　 MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的家族之一，有著廣泛的生理功能，幾乎參與植物發(fā)育和代謝的各個(gè)方面。在模式植物擬南芥(Arabidopsis)中，已克隆多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，并鑒定其和表皮毛(Trichome)發(fā)育相關(guān)。CPC是表皮毛發(fā)育的負(fù)向調(diào)控因子，和bHLH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，并抑制葉片表皮毛發(fā)育。
　　 本研究從TM-1開(kāi)花當(dāng)天胚

7、珠中克隆棉花CAPRICE(CPC)基因cDNA全長(zhǎng)，包含240bp的ORF，編碼79個(gè)氨基酸，包含典型的R3-MYB基序?？寺hCPC在棉花突變體材料中的不同拷貝，分析了核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列差異。基因組序列分析推測(cè)陸地棉的CPC基因可能來(lái)自G.herbaceum(A-genome)，基因組序列平均每73 bp一個(gè)SNP突變?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CPC基因在陸地棉TM-1不同時(shí)期的胚珠或纖維、根、葉中均有表達(dá)，表達(dá)最高值出現(xiàn)在3 D

8、PA的纖維，TM-1的莖不表達(dá)。分析該基因在不同突變體中的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，0、1、3 DPA，TM-1中的表達(dá)量明顯低于無(wú)絨無(wú)絮和無(wú)絨有絮突變體的表達(dá);TM-1葉片中的表達(dá)量明顯高于密生絨毛品系T586中的表達(dá);在RIL純系中，有絨有絮純系的平均值顯著低于無(wú)絨有絮純系和無(wú)絨無(wú)絮純系。單標(biāo)記分析，CPC基因和纖維表型性狀是相關(guān)的。
　　 TAIL-PCR克隆CPC基因的啟動(dòng)子，陸地棉和G.herbaceum的CPC基因啟動(dòng)子包含GA

9、RE-motif，而G.ramondii沒(méi)有。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化上述兩種啟動(dòng)子，證明其都有轉(zhuǎn)錄活性。CPC基因轉(zhuǎn)化離體培養(yǎng)的胚珠，顯著抑制纖維的生長(zhǎng)，并受到GA3的影響。由此推測(cè)，CPC基因是棉花纖維發(fā)育的負(fù)向調(diào)控因子。
　　 3、棉花GhDIS2基因的克隆與初步功能分析
　　 轉(zhuǎn)錄因子隨核細(xì)胞骨架運(yùn)輸?shù)秸{(diào)控位點(diǎn)，細(xì)胞骨架的形成和解聚影響轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。擬南芥DISTORTED2(DIS2)編碼ARP2/3復(fù)合體的ARPC2亞基。

10、dis2突變表現(xiàn)表皮層肌動(dòng)蛋白成斑狀、微管在成簇的肌動(dòng)蛋白附近異常聚集等。
　　 運(yùn)用同源候選基因法從開(kāi)花當(dāng)天野生型胚珠中克隆棉花GhDIS2，該基因包括完整的975 bp的ORF，編碼324個(gè)氨基酸。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，它在陸地棉TM-1不同來(lái)源的組織中均表達(dá)，于開(kāi)花后12 d達(dá)到表達(dá)高峰，開(kāi)花后18 d表達(dá)開(kāi)始下降，根和莖的表達(dá)量較低。在四倍體棉花基因組中存在2個(gè)拷貝。轉(zhuǎn)化裂殖酵母，使該基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，GhDIS2促使細(xì)胞擴(kuò)