一種harpin基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)及體外使用harpin蛋白誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)的研究.pdf

1、Harpin是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類蛋白類激發(fā)子，它們的共同特征是：富含甘氨酸，熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感，在寄主植物上產(chǎn)生致病性，在非寄主植物葉片上可以誘導(dǎo)Hypersensitiveresponse（HR）或Hypersensitivecelldeath（HCD）。當(dāng)外源使用harpin時(shí)，可以誘導(dǎo)多種植物抗病、抗蟲、耐旱，并可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但是，對(duì)于harpin多重功能的分子機(jī)理，目前還不清楚，為深入研究harpin信號(hào)在植

2、物體內(nèi)傳導(dǎo)的機(jī)制，選取了目前研究較多的由水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae的HpaGXoo和薔薇科植物火疫病的病原細(xì)菌Erwiniaamylovora產(chǎn)生的HrpNEa作為研究對(duì)象，產(chǎn)生了表達(dá)HpaGXoo的轉(zhuǎn)基因擬南芥，并測(cè)定了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病防衛(wèi)反應(yīng)；同時(shí)，為了確定HrpNEa誘導(dǎo)有益表型的廣譜性，研究了HrpNEa在甜瓜上誘導(dǎo)蚜蟲趨避效應(yīng)。
　　 1.HpaGXoo在擬南芥中轉(zhuǎn)基因表達(dá)促進(jìn)

3、植物生長(zhǎng)和抗病性
　　 我們將編碼HpaGXoo的基因hpaGXoo構(gòu)建到pBI121雙元載體上，通過(guò)真空花絮滲透法轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得表達(dá)HpaGXoo的擬南芥（HpaGXoo-expressingArabidopsis，HEAT1）轉(zhuǎn)基因系。對(duì)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行了以下分子驗(yàn)證：通過(guò)PCR方法，確定了hpaGXoo基因穩(wěn)定整合在擬南芥基因組中；RT-PCR證明了hpaGXoo基因在擬南芥中可以轉(zhuǎn)錄；從轉(zhuǎn)基因擬南芥中提取的HpaGXoo蛋

4、白能夠在煙草上誘導(dǎo)HR；同時(shí)根據(jù)SDS-PAGE電泳，明確了轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的HpaGXoo蛋白的大小沒(méi)有改變（15.6kD）。這些結(jié)果表明，hpaGXoo基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)可以正常翻譯為有活性的、完整的HpaGXoo分子。另外，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同株系進(jìn)行抗病性實(shí)驗(yàn)，選擇了具有一定代表性的細(xì)菌菌株P(guān).syringaepv.tomatoDC3000接種擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)基因株系都獲得了對(duì)該細(xì)菌的抗性。同時(shí)對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)基因N

5、PR1、PR-1和PR3b的表達(dá)進(jìn)行了RT-PCR測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因株系中，防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因都有一定增強(qiáng)表達(dá)。然后trypanblue染色證明所有的轉(zhuǎn)基因株系都沒(méi)有micro-HR的發(fā)生，這種現(xiàn)象與外源噴施擬南芥發(fā)生了不同。根據(jù)以上結(jié)果，我們認(rèn)為HpaGXoo在擬南芥中轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)基因的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌的抗病性，但不能誘發(fā)micro-HR。另外，是否帶有信號(hào)肽對(duì)hpaGXoo基因在植物體內(nèi)表達(dá)后所誘導(dǎo)的促

6、生長(zhǎng)和抗病沒(méi)有影響。
　　 2.HpaGXoo融合蛋白的表達(dá)、純化及抗體制備
　　 HpaGXoo同其他harpin一樣，在植物上可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種效應(yīng)，但是對(duì)于該蛋白在植物上是如何起作用，在什么部位起作用，目前還不清楚。已有人報(bào)道了harpin在植物細(xì)胞中的作用部位，但對(duì)不同harpin的研究結(jié)果不盡相同。為了進(jìn)一步研究HpaGXoo在植物中的作用部位，我們構(gòu)建了可用于HpaGXoo蛋白純化的高效表達(dá)載體，原核表達(dá)、純化

7、了融合蛋白，并制備了抗血清。我們利用PCR方法從水稻白葉枯病菌的基因組DNA中擴(kuò)增得到hpaGXoo基因，連接pET30a（+）載體，該載體上保留了蛋白質(zhì)純化所需的Histag編碼序列。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）產(chǎn)生表達(dá)菌株。表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，產(chǎn)生分子量為21.6kD大小的組氨酸標(biāo)記的融合蛋白條帶。利用HisTrapHPKit試劑盒對(duì)HpaGXoo融合蛋白進(jìn)行了純化，并得到21.6k

8、D大小的單一條帶。該純化蛋白可以在煙草上引起典型的過(guò)敏性反應(yīng)，我們將純化的HpaGXoo蛋白免疫家兔，獲得了HpaGXoo蛋白的多克隆抗體，間接ELISA方法測(cè)定抗血清的效價(jià)達(dá)到1:16，000以上。同時(shí)利用Westernblot對(duì)蛋白與抗體之間的特異性結(jié)合進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，不論是粗蛋白還是純化蛋白在相應(yīng)的位置上都有很強(qiáng)的雜交信號(hào)，而空載體提取物在相應(yīng)的位置沒(méi)有任何信號(hào)。我們提取了植物中表達(dá)的HpaGXoo蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了雜交分析

9、，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的HpaGXoo蛋白和原核表達(dá)的一樣可以和抗血清特異性識(shí)別并產(chǎn)生較強(qiáng)的雜交信號(hào)，由于該蛋白原核表達(dá)融合了his-tag，故比植物中表達(dá)的蛋白條帶大，因此雜交信號(hào)不在一條直線上。
　　 3.HrpNEa在甜瓜上誘導(dǎo)韌皮部防衛(wèi)和蚜蟲趨避效應(yīng)
　　 植物韌皮部相關(guān)防衛(wèi)（plantphloem-baseddefense，PBD）能夠抵抗刺吸式昆蟲的取食。已知HrpNEa類生物激發(fā)子能夠激發(fā)抗蟲信號(hào)傳導(dǎo)

10、途徑，可能參與了韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)的誘導(dǎo)，但是HrpNEa的這種誘導(dǎo)抗蟲性是否在其他植物上有廣譜性還沒(méi)有證實(shí)。RT-PCR及化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HrpNEa處理后可以增加在韌皮部產(chǎn)生韌皮部相關(guān)蛋白的表達(dá)及胼胝質(zhì)的沉積，兩者共同構(gòu)成了PBD反應(yīng)，并且有利于蚜蟲驅(qū)避、減少蚜蟲在韌皮部的取食活動(dòng)；對(duì)甜瓜野生型和HrpNEa處理的植株蚜蟲趨避效應(yīng)以及蚜蟲刺吸電子信號(hào)分析，結(jié)果表明蚜蟲更喜好取食對(duì)照植株；此外，HrpNEa處理增加了蚜蟲對(duì)葉片的試探性