甜菜堿對(duì)朗德鵝原代肝細(xì)胞脂肪沉積影響的研究.pdf

1、甜菜堿具有影響脂肪代謝的作用，可重新分配體內(nèi)脂肪，但在不同物種間的表現(xiàn)形式和具體機(jī)制各不相同。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿對(duì)朗德鵝肝脂代謝的影響極具特殊性:降低了高能碳水化合物填飼的朗德鵝的皮脂和腹脂重，卻增加了鵝肥肝重。本研究以此為切入點(diǎn)，以朗德鵝原代肝細(xì)胞為研究材料，通過(guò)在WME完全培養(yǎng)基上添加不同濃度的葡萄糖誘導(dǎo)鵝肝細(xì)胞脂肪沉積，來(lái)模擬高能碳水化合物誘導(dǎo)的肥肝細(xì)胞，構(gòu)建體外肥肝細(xì)胞模型。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性、TG含量和油紅O染色確定合

2、適的葡萄糖誘導(dǎo)濃度。在合適的葡萄糖誘導(dǎo)濃度上添加不同濃度的甜菜堿，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性、TG含量和油紅O染色確定合適的甜菜堿處理濃度。然后在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)立正常對(duì)照組，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)組和甜菜堿處理組，比較了不同組不同時(shí)間段朗德鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和大小脂滴分布情況，通過(guò)試劑盒測(cè)定線粒體膜電位變化來(lái)推測(cè)脂肪酸在線粒體的β-氧化情況，用熒光定量方法檢測(cè)脂質(zhì)合成、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)等影響肥肝生成的主要途徑的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，并用weston bl

3、ot方法檢測(cè)脂肪分化關(guān)鍵基因PPARγ和C/EBPβ的蛋白表達(dá)變化。鑒于C/EBPβ基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均差異極顯著，擴(kuò)增出其完整的DNA序列，進(jìn)行生物信息學(xué)和組織表達(dá)分析，并檢測(cè)該基因核心啟動(dòng)子活性區(qū)和結(jié)構(gòu)功能域的甲基化情況。主要結(jié)果如下:
　　(1)用不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)朗德鵝肝細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，濃度低于5mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)組TG含量與對(duì)照組差異不顯著，濃度在10-50mmol/L間的葡萄糖誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)組TG含量顯著高于對(duì)照組(P＜

4、0.05)，濃度高于100mmol/L時(shí)肝細(xì)胞因沉積脂質(zhì)過(guò)多而碎裂漲破，誘導(dǎo)組TG含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。葡萄糖濃度不大于50mmol/L時(shí)，細(xì)胞活性較為穩(wěn)定，濃度高于100mmol/L時(shí)會(huì)超過(guò)細(xì)胞的耐受性，不利于細(xì)胞存活。最終確定20mmol/L為本試驗(yàn)最佳葡萄糖誘導(dǎo)濃度。
　　(2)在20mmol/L的最佳葡萄糖誘導(dǎo)濃度下添加不同濃度的甜菜堿共同培養(yǎng)鵝肝細(xì)胞，不同的甜菜堿處理濃度對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響差異顯著:甜

5、菜堿濃度小于10mmol/L的處理組，細(xì)胞內(nèi)總TG含量與以單獨(dú)高濃度葡萄糖培養(yǎng)的誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)總TG含量沒(méi)有差異，甜菜堿濃度在20-30mmol/L的處理組可顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，總TG含量顯著高于葡萄糖誘導(dǎo)組(P＜0.05)，當(dāng)甜菜堿濃度高達(dá)50mmol/L時(shí)處理組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積受到抑制，TG含量顯著降低(P＜0.01)。最終確定20mmol/L為本試驗(yàn)最佳甜菜堿處理濃度。
　　同一組不同時(shí)間段TG沉積水平差異均極顯著(P＜0.

6、01)。不同組不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小分布差異明顯，三組內(nèi)誘導(dǎo)組的大脂滴最大，數(shù)量最多，分布最不均勻;誘導(dǎo)組大脂滴數(shù)最少，小脂滴數(shù)最多，脂滴分布最均勻;對(duì)照組居于其它兩組之間。
　　(3)比較不同組間不同時(shí)間段朗德鵝原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和大小脂滴分布情況發(fā)現(xiàn):各時(shí)間段誘導(dǎo)組和處理組的TG含量均高于對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)。12h時(shí)，誘導(dǎo)組和處理組的TG含量差異不顯著，24h和48h時(shí)處理組細(xì)胞內(nèi)總TG含量均高于誘導(dǎo)

7、組，且差異顯著(P＜0.05)。同一組不同時(shí)間段TG沉積水平差異均極顯著(P＜0.01)。不同組不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小分布差異明顯，三組內(nèi)誘導(dǎo)組的大脂滴最大，數(shù)量最多，分布最不均勻;處理組大脂滴數(shù)最少，小脂滴數(shù)最多，脂滴分布最均勻;對(duì)照組居于其它兩組之間。
　　線粒體膜電位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組的線粒體膜電位下降，甜菜堿恢復(fù)了處理組的線粒體膜電位，差異顯著(P＜0.05)，處理組與對(duì)照組的線粒體膜電位差異不顯著。甜菜堿降低脂肪

8、合成通路關(guān)鍵基因FAS和SREBPc、脂肪沉積關(guān)鍵基因DGAT2、調(diào)控肝內(nèi)脂代謝的關(guān)鍵基因LXRα和PPARα基因、脂肪分化基因C/EBPβ和PPARγ基因表達(dá)水平，升高脂肪酸水解及轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因MTP和LPL表達(dá)水平，與誘導(dǎo)組相比差異顯著或極顯著。甜菜堿抑制了C/EBPβ蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，但沒(méi)有改變PPARγ蛋白表達(dá)量。
　　(4)克隆獲得朗德鵝C/EBPβDNA完整序列2075bp，包含984bp的開(kāi)放閱讀框及5’端

9、部分序列。分析發(fā)現(xiàn)，鵝C/EBPβ基因無(wú)內(nèi)含子，整個(gè)序列是一個(gè)長(zhǎng)CpG島。其蛋白序列與雞和人的序列分別有96.66％和62.07％的相似性。理論等電點(diǎn)pI為8.696，被定位于胞核，無(wú)跨膜區(qū)，不合明顯的疏水區(qū)，不存在信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白。組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，該基因在鵝肝臟和脂肪組織中表達(dá)量較高?；铙w實(shí)驗(yàn)不同組間鵝肝中C/EBPβ的相對(duì)表達(dá)情況顯示，甜菜堿抑制該基因的表達(dá)(P＜0.05)。亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)不同組間C/EBPβ基因的甲