犬α7干擾素在大腸桿菌與畢赤酵母中的活性表達(dá)及分析.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由特定細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性的分泌型糖蛋白，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。近年來，由于干擾素具有無藥物殘留，無毒副作用的特點(diǎn)，使其在防治畜禽疫病特別是病毒性疫病方面越來越受到關(guān)注。但是犬干擾素-α(CaIFN-α)的研究和應(yīng)用相對(duì)落后。
　　 1.為了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)具有抗病毒活性的犬α干擾素，在犬肝臟組織中克隆獲得犬α干擾素第7亞型(

2、CaIFN-α7)基因，通過融合PCR的方法在犬α干擾素的N端無縫連接內(nèi)含肽Ssp DnaB intein(SDI)基因，然后連接入pMAL-c2X載體中，構(gòu)建含有內(nèi)含肽和麥芽糖結(jié)合蛋白基因的重組表達(dá)載體。重組載體在大腸桿菌感受態(tài)Rosetta中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)可溶性CaIFN-α蛋白，經(jīng)直鏈淀粉樹脂純化后可得到純度較高的目的蛋白。重組蛋白在MDCK上對(duì)CDV及VSV的抑制活性分別為3.5×105U/mg和3.9×105U/mg。

3、
　　 2.為了使表達(dá)的犬α干擾素具有無冗余氨基酸的N端，本研究將犬α干擾素基因連接入pPICZαA載體的分泌信號(hào)肽序列后，用LiCl轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入酵母菌GS115中，對(duì)培養(yǎng)基上清進(jìn)行簡單處理進(jìn)行SDS-PAGE分析，表達(dá)的蛋白約25ku。分析原因，是由于在犬α干擾素基因序列中有2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，表達(dá)產(chǎn)物被糖基化修飾。酵母表達(dá)的犬α干擾素在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分別為9.6×106U/mg和1.1×107U/mg。