胎盤干擾素（IFN-tau）在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及活性測定.pdf

1、研究目的： 因IFN-τ僅在特定的時(shí)間、空間才會表達(dá)，并且直接組織培養(yǎng)和提取也很繁瑣和復(fù)雜。所以，本實(shí)驗(yàn)擬采用基因工程技術(shù)，將克隆的oIFN-τ(綿羊IFN-τ)τ片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌，使oIFN-τ成熟肽在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并探索簡單有效的roIFN-τ(recombinantovineinterferon-tau，重組綿羊IFN-τ)純化、復(fù)性方法，獲得高純度高活性的roIFN-τ。為今后大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 研究

2、方法： ■載體構(gòu)建與目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) (1)PCR法擴(kuò)增oIFN-τ完整成熟肽編碼基因。 (2)構(gòu)建oIFN-τ/pBV220/E.coliBL21工程菌。 (3)升溫誘導(dǎo)oIFN-τ表達(dá)；超聲裂解確定目的蛋白的表達(dá)方式及最佳表達(dá)時(shí)間。 (4)蛋白N端測序鑒定目的蛋白。 ■roIFN-τ的發(fā)酵表達(dá)與純化復(fù)性 (1)上發(fā)酵罐，培養(yǎng)工程菌并升溫誘導(dǎo)oIFN-τ的表達(dá)。 (2)

3、超聲裂解菌體獲取包涵體，洗液洗滌后以8M尿素變性溶解。 (3)對變性溶解的包涵體蛋白以硫酸銨沉淀法粗純化，對所獲硫酸銨沉淀以包涵體溶解液洗滌的方法進(jìn)一步去除雜蛋白。 (4)初純化后的包涵體梯度透析復(fù)性。 (5)DEAE-FF陰離子交換柱對復(fù)性后蛋白進(jìn)行再次純化。 ■重組IFN-τ的活性測定 MTF法測定roIFN-τ比活性。 研究結(jié)果： ■載體構(gòu)建與目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) (1

4、)對基因的修飾和改造使roIFN-τ成熟肽在大腸桿菌中成功表達(dá)，目的蛋白占菌體總蛋白量的約20％。 (2)確定了roIFN-τ以包涵體方式表達(dá)，誘導(dǎo)后4h為最佳表達(dá)時(shí)間。 ■roIFN-τ的發(fā)酵表達(dá)與純化復(fù)性 (1)裂解菌體，獲取包涵體沉淀，并洗滌，Bandscan軟件測定目的蛋白占菌體總蛋白量由約20％升至33％。 (2)以45％百分飽和度的硫酸銨沉淀蛋白液，取沉淀，目的蛋白含量升至44.1％，對所獲沉

5、淀以包涵體溶解液洗滌的辦法重復(fù)3次，目的蛋白百分比依次升至58.6％、67.0％和86.3％。 (3)4℃條件下，進(jìn)行梯度透析，發(fā)現(xiàn)很少沉淀形成 (4)對復(fù)性后的蛋白進(jìn)行DEAE-FF柱純化，純度又得到大幅提高。得到純度＞95％的roIFN-τ。 ■重組IFN-τ的活性測定 MTT法測定復(fù)性后roIFN-τ的標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)為2.09×107IU/mL，比活性為2.35×107IU/mg。 結(jié)論：