豬α-干擾素的原核表達及其活性測定.pdf

1、近些年來，豬的病毒性疾病時常危害著養(yǎng)豬業(yè)的正常發(fā)展，研究表明豬α-干擾素具有顯著的抗病毒功能，對豬的很多種病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、藍耳病、傳染性胃腸炎等都有一定防治效果。目前，利用基因工程手段研制和開發(fā)重組干擾素制劑已成為研究熱點，并已有多種類型干擾素產(chǎn)品成功上市，但仍遠遠滿足不了市場需求。本文對豬IFN-α密碼子序列進行了優(yōu)化改造，并采用原核表達系統(tǒng)對豬IFN-α成功進行了表達，純化及抗病毒活性研究，為重組豬IFN-α的生產(chǎn)

2、和應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 一、豬α-干擾素基因序列的改造與克隆 本研究在前期獲得豬IFN-α基因序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)大腸桿菌的偏嗜性，對其密碼子序列進行改造。改造后的豬IFN-α-基因序列與原序列相比，堿基改變79個，占全基因序列的16％；密碼子改變63個，占總密碼子數(shù)的38％;基于原序列中含有5個編碼半胱氨酸的密碼子，為防止蛋白折疊中二硫鍵的錯配，將第86位半胱氨酸密碼子(UGC)改造為酪氨酸密碼子(UAC)，使得Cysl

3、-Cys99，Cys29-Cys139之間形成兩個分子內(nèi)二硫鍵。改造后序列以引物的形式分段合成，采用重疊延伸PCR(SOE PCR)進行依次擴增，并最終獲得改造后的豬IFN-α全基因序列；將改造后的豬IFN-α基因克隆到pMT-Easy載體中，酶切及測序鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建克隆載體pMT-poIFN-α。 二、重組豬α-干擾素的原核表達、鑒定與純化 重新設(shè)計引物，并引入Ndel、EcoRI酶切位點，構(gòu)建重組豬α-干擾

4、素的原核表達載體pET28-poIFN-α，酶切及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，添加IPTG誘導(dǎo)表達；經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約21kDa的位置出現(xiàn)明顯的新生蛋白條帶，與目的蛋白分子量大小相近，采用Western Blot對其進一步進行鑒定后，表明重組豬α-干擾素成功獲得了表達。目的蛋白為N端帶有(His)6標(biāo)簽的融合蛋白，主要以包涵體形式存。對表達條件(誘導(dǎo)時間、溫度及IPTG濃度)進行優(yōu)化后，目的蛋白

5、占到菌體總蛋白的39.8％，實現(xiàn)了重組豬α-干擾素在大腸桿菌中的高效表達。表達產(chǎn)物經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析方法進行純化后，目的蛋白純度達到90％以上，獲得了較高純度的重組豬α-干擾素。 三、重組豬α-干擾素抗病毒活性研究 純化后的重組豬α-干擾素經(jīng)流加稀釋法復(fù)性后，采用MDBK/VSV與PK15/VSV系統(tǒng)分別鑒定了重組豬α-干擾素的抗病毒活性，并采用微量細胞病變抑制法，通過MDBK/VSV系統(tǒng)測定了重組豬α-干擾素的抗病