新型重組豬α-干擾素的制備及其活性分析.pdf

1、干擾素是機體在一系列誘導因素的作用下，產生的一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)功能的細胞因子。從1957年Isaacs和Lindenmann發(fā)現(xiàn)至今，已有很多關于干擾素的研究報道，其中大多數(shù)是著重于干擾素的規(guī)?；a研究，以滿足在疾病治療方面的需求。IFN作為動物體內所知作用最快的第一道防御體系，對病毒性疾病的治療起到極其重要的作用。但是IFN機體自身表達量較低，無法滿足防治疾病的要求。所以利用基因工程技術，體外大規(guī)模獲得IFN十分必要。

2、目前所知的干擾素表達系統(tǒng)有大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、動物細胞表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達系統(tǒng)目前研究較為深入，具有培養(yǎng)條件簡單，操作容易，培養(yǎng)周期短，成本低，產量高，易于規(guī)?；扔袃?yōu)點。不足之處是其表達的蛋白常以包涵體的形式存在。本實驗，構建了pET32-PoIFNα/BL21(DE3)重組菌株，并可溶性的表達出了PoIFNα。純化，WB鑒定后，進行了生物活性測定，結果表明具有較好的抗病毒活性。主要結果如下：
　

3、　根據GeneBank中報道的豬α干擾素基因序列（M28623），設計一對引物。以豬肝臟基因組DNA為模板，PCR擴增出豬α干擾素成熟肽基因?？寺〉絧ET32質粒中，構建了重組質粒pET32α-PoIFNα。經PCR鑒定，雙酶切鑒定和測序鑒定后，轉化入BL21（DE3），篩選得到含表達質粒的基因工程菌pET32-PoIFNα/BL21(DE3)。
　　誘導重組菌株表達，產物經SDS-PAGE蛋白電泳分析，在3.8×104的位置出現(xiàn)

4、了目的蛋白條帶，與預期相符。并且，通過還原上樣緩沖液和非還原上樣緩沖液兩種方法處理樣品，證明表達蛋白是以有活性的單體形式存在的。經過溫度、IPTG、誘導時間的摸索，確定了可溶性表達的最佳條件為22℃、0.5mMIPTG、誘導10h。在最佳條件下，大規(guī)模誘導工程菌，表達產物經鎳柱親和層析純化，得到了純度較高的重組蛋白。WB鑒定，進一步證實了表達產物確實為PoIFNα。純化產物透析除鹽后凍干，4℃冰箱保存。
　　使用干擾素預處理Mar