豬γ干擾素的克隆表達及其聯(lián)合中藥抗PRRSV的研究.pdf

1、本研究克隆表達了具有生物學活性的豬γ干擾素，并在篩選出具有抗PRRSV作用中藥的基礎上，評價了重組豬γ干擾素與中藥聯(lián)合抗PRRSV的效果。 1.豬γ干擾素的克隆表達。 根據(jù)GenBank基因庫中已登錄的豬γ干擾素(Porcine Interferon gamma，PolFN-γ)基因設計一對引物，通過RT-PCR技術，以豬脾臟總RNA為模板，擴增出了豬γ-干擾素基因，其大小約為500 bp，與理論大小相符。目的片段經純化

2、回收后，克隆到pMD18-T載體，經序列測定，擴增得到的序列與已報道的豬IFN-γ序列基本一致，同源性在99％以上，發(fā)生一個點突變，核苷酸由G突變?yōu)锳，相應氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸，但同為堿性、極性氨基酸，將測得的目的基因序列進行分析，得出目的蛋白的理論分子量為18.033KD，理論等電點為9.54。 將PolFN-γ基因插入大腸桿菌表達載體pET-28a(+)，成功構建了重組質粒PoIFN-γ/pET-28a(+)，再將其轉

3、化入大腸桿菌BL21，在37℃，IPTG終濃度為1 mmol/L條件下誘導4 h，成功表達了重組：PoIFN-γ，經SDS-PAGE分析表明，目的蛋白大小約為20 KD，主要以包涵體形式存在，占菌體總蛋白的37.2％。 經Western-Blot檢測證實，重組PoIFN-γ的N端含有6個組氨酸標簽。蛋白經純化、復性、濃縮，用Vero-VSV系統(tǒng)測得抗病毒效價約為1.3×10<'3.>U/mL(5.0×10<'3>U/mg)。為開

4、展中藥聯(lián)合豬γ-干擾素抗病毒的研究及基因工程生產重組PoIFN-γ奠定了基礎。 2.中藥體外抗PRRSV的篩選及聯(lián)合重組PoIFN-γ抗PRRSV的研究。 利用Marc-145細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，通過CPE和MTT法測定了板藍根、野菊花、穿心蓮、黃芪、金銀花、魚腥草、柴胡、黃連、連翹、甘草、黃芩和紫花地丁，共12味中藥在Marc-145細胞上的最大無毒濃度(TC<,0>)、半數(shù)中毒濃度(TC<,50>)，并篩選了有效的抗P

5、RRSV中藥，計算了半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)和治療指數(shù)(TI)。 12味中藥對Marc-145細胞的最大無毒濃度(TC<,0>)以及對PRRSV的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)分別為：板藍根31.25 mg/mL，1.38 mg/mL；野菊花7.81 mg/mL，1.30mg/mL；穿心蓮7.81 mg/mL，0.91 mg/mL；黃芪3.90 mg/mL，0.22mg/mL；金銀花31.25mg/mL，2.08mg/mL

6、；魚腥草3.90 mg/mL，0.44 mg/mL；柴胡15.63 mg/mL，2.54mg/mL；黃連3.90 mg/mL，0.35 mg/mL；連翹7.81mg/mL，1.28 mg/mL；甘草15.63 mg/mL，2.62 mg/mL；黃芩0.98 mg/mL，0.13mg/mL；紫花地丁31.25mg/mL，2.47 mg/mL。重組.PoIFN-γ的IC<,50>為99.50 U/mL。12味中藥中治療指數(shù)位于前三位的是黃芪