家蠶中腸和培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、利用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)家蠶5齡期不同發(fā)育時(shí)期的中腸蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較研究；通過多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)5齡期第2天家蠶幼蟲的中腸蛋白質(zhì)組組成進(jìn)行了分析，通過一維電泳、多維液相色譜分離技術(shù)以及串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合的方法對(duì)BmNPV感染前后的家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組組成進(jìn)行了分析研究，對(duì)比它們之間的差異性。在此基礎(chǔ)上通過生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的2種抗病毒蛋

2、白的分子生物學(xué)特征以及抗病毒活性進(jìn)行了分析和研究。主要結(jié)果如下：
　　 1、對(duì)家蠶5齡期第2天、第5天和第7天的中腸組織蛋白質(zhì)進(jìn)行了2D電泳，建立不同時(shí)期標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)參考圖譜。利用ImageMaster2D Platinum對(duì)蛋白圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家蠶中腸蛋白質(zhì)大多分布在pI值4-8、分子量20-70 kDa的區(qū)域。5齡期家蠶第2天的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目為869個(gè)，第5天為966個(gè)，新增蛋白數(shù)目97個(gè)，增加的蛋白主要分布在pI6-9，

3、分子量20-40 KDa區(qū)間；進(jìn)入幼蟲成熟期（第7天）的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目明顯減少，僅為420個(gè)，斑點(diǎn)數(shù)減少了56.5％。利用MALDI-TOF-MS對(duì)差異表達(dá)的部分蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)在5齡期初期和旺食期（第2天和第5天），表達(dá)量較大的蛋白主要是由家蠶中腸的肌肉層和上皮層的結(jié)構(gòu)蛋白，與中腸消化和吸收功能相關(guān)的蛋白以及與家蠶細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白組成，它們分別是肌動(dòng)蛋白、胞質(zhì)型肌動(dòng)蛋白A3al、微管蛋白α-8鏈、角蛋白1、熱激70 kDA蛋

4、白類似物3、液泡性ATP合成酶催化單位A、硫醇抗氧化蛋白、AGL165Wp、精氨酸激酶等、血淋巴3nk蛋白（基因6G1）和主要血漿蛋白30 k等。這些蛋白大多數(shù)在家蠶5齡期末期表達(dá)量下降，甚至完全降解，除液泡性ATP合成酶催化單位A以外。液泡性ATP合成酶催化單位A表達(dá)量上升可能和家蠶中腸5齡期末期需要大量的能量降解家蠶中腸本身的組織蛋白，從而盡快消化失去生物功能的家蠶中腸組織有關(guān)。
　　 2、為了進(jìn)一步詳細(xì)解析中腸蛋白質(zhì)組的組

5、成并解釋中腸的生物學(xué)功能,利用納米液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析了家蠶中腸的蛋白質(zhì)組，獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用X!Tandem搜索軟件通過不同的參數(shù)進(jìn)行分析，并且通過泊松模型進(jìn)行確認(rèn)，最終共獲得90個(gè)蛋白點(diǎn)。其中79個(gè)蛋白點(diǎn)被首次描述，發(fā)現(xiàn)22個(gè)蛋白點(diǎn)與中腸的消化功能密切相關(guān)，包括中腸上皮細(xì)胞分泌的11種酶，腸壁肌肉所需要的8種驅(qū)動(dòng)蛋白和防止食物摩擦腸壁受傷的3種圍食膜蛋白；44種蛋白與物質(zhì)和能量的代謝相關(guān)；11種蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞

6、骨架相關(guān)。
　　 3、利用一維SDS凝膠電泳和串聯(lián)質(zhì)譜連用的方法研究家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN蛋白質(zhì)組的組成，鑒定到1478種的蛋白質(zhì)，通過GO分類注釋發(fā)現(xiàn)，這些蛋白具有不同的等電點(diǎn)和分子量，含有多種不同的生物活性，像催化活性、結(jié)合活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、動(dòng)力活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、酶調(diào)節(jié)活性以及抗氧化活性。利用相同的方法研究BmNPV感染后BmN培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)組組成，鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目為303個(gè)，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，感染后新出現(xiàn)的特異蛋白點(diǎn)數(shù)目有8個(gè)

7、，分別是微管蛋白β-1，脂肪酶，絲氨酸蛋白酶2，ICE-5蛋白，網(wǎng)格蛋白，鳥氨酸結(jié)合蛋白，凋亡蛋白激活因子以及另外一個(gè)未知的蛋白。在這些蛋白中，網(wǎng)格蛋白、微管蛋白β-1和病毒的侵染途徑有關(guān)；脂肪酶、絲氨酸蛋白酶以及鳥氨酸結(jié)合蛋白和抗病毒相關(guān)；而ICE-5蛋白、凋亡蛋白激活因子和家蠶BmN細(xì)胞凋亡相關(guān)，最后一種蛋白的功能未知。
　　 4、對(duì)上述發(fā)現(xiàn)的抗病毒蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步分析，從中國家蠶和野蠶幼蟲中腸細(xì)胞克隆獲得了抗家蠶核型多角體

8、病毒BmNPV的脂肪酶基因Lipase cDNA(GenBank AY945209和AY945212)。對(duì)野蠶中的抗病毒蛋白進(jìn)行了重點(diǎn)研究。野蠶基因Lipase cDNA大小906 bp，編碼301個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為28.9 kD。進(jìn)一步克隆了其基因組全長，結(jié)果表明野蠶基因由2147 bp組成，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。分析了該基因在野蠶體內(nèi)的活動(dòng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)具有組織特異性，僅限于野蠶中腸組織表達(dá)；該基因在幼蟲齡中

9、表達(dá)水平較高，而在幼蟲眠期和熟蠶內(nèi)幾乎沒有表達(dá)。通過基因的體外表達(dá)獲得重組蛋白Lipase，發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠有效抑制BmNPV病毒對(duì)家蛋的感染，說明該蛋白具有較強(qiáng)的抗BmNPV的生物學(xué)活性。
　　 5、從野蠶中腸內(nèi)克隆了抗家蠶BmNPV病毒的SP-2 cDNA(GenBank登錄號(hào)：AY945210)，基因大小855bp，編碼284個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量29.6kDa，基因組全長1376bp，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。該基因的