家蠶圍食膜與BmNPV抗性相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、圍食膜(peritrophic membrane,PM)是昆蟲體內(nèi)非常重要的中腸防御系統(tǒng)。近年來對(duì)于圍食膜在生物化學(xué)及其分子生物學(xué)水平上的了解日趨增多,但是家蠶圍食膜蛋白的研究還不是很豐富,尤其是家蠶圍食膜與家蠶核型多角體病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)病抗性相關(guān)蛋白的研究仍舊匱乏。因此,本研究以家蠶圍食膜作為研究對(duì)象,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)BmNPV抗性、感性及其近等基因系的圍食膜的蛋白

2、質(zhì)表達(dá)譜以及差異表達(dá)譜進(jìn)行分析,為進(jìn)一步探索家蠶對(duì)BmNPV病毒的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)對(duì)抗性、感性及其近等基因系三個(gè)品系家蠶,在相同的條件下飼養(yǎng),對(duì)5齡起幼蟲經(jīng)口接種BmNPV病毒,24h后,解剖幼蟲取出圍食膜并觀察外觀形態(tài),并將正常飼養(yǎng)未接種病毒的作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染病毒后,三個(gè)品系家蠶幼蟲的圍食膜均表現(xiàn)為長(zhǎng)度變短、韌性降低、質(zhì)地混濁,但是感性品系306幼蟲的圍食膜特別明顯地變薄變脆

3、,暗示著家蠶圍食膜極有可能與抗BmNPV病毒有關(guān)。
　　 (2)比較平衡酚-醋酸銨甲醇沉淀法和三氯乙酸(TCA)-丙酮法對(duì)于家蠶圍食膜蛋白的提取效率及提純度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TCA-丙酮法對(duì)于家蠶圍食膜蛋白的提取效果較好,蛋白質(zhì)純度較高,并且操作簡(jiǎn)單,能夠滿足二維電泳分離的要求,因此,選擇該法作為家蠶圍食膜蛋白的提取方法。
　　 (3)利用二維凝膠電泳技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定技術(shù)對(duì)

4、家蠶圍食膜的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析?？偣卜蛛x到27個(gè)圍食膜蛋白,并鑒定了其中的23個(gè)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)家蠶圍食膜蛋白涉及結(jié)合、催化、代謝過程等生理活動(dòng)。
　　 (4)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)BmNPV抗性與感性品系家蠶的圍食膜蛋白進(jìn)行研究,找出家蠶圍食膜上與BmNPV抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。二維電泳后總共分離鑒定到27個(gè)僅出現(xiàn)在抗性品系NB和BCs中的差異蛋白點(diǎn),其中3個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)在經(jīng)口接種BmNPV病毒的NB品系家蠶圍食膜中,12個(gè)蛋白

5、點(diǎn)出現(xiàn)在未接種病毒的NB對(duì)照組;4個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)在經(jīng)口接種BmNPV病毒的BCs品系家蠶圍食膜中,8個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)在未接種病毒的BCs對(duì)照組,推測(cè)這些蛋白有可能與抗BmNPV病毒有關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些抗性相關(guān)的差異蛋白在結(jié)合、催化、細(xì)胞進(jìn)程和高分子代謝過程等方面的功能較為顯著。此外,在27個(gè)蛋白點(diǎn)中,NB對(duì)照組與BCs對(duì)照組共有的蛋白點(diǎn)有5個(gè),分別是Trypsin-likeprotease(胰蛋白酶類蛋白酶)、Metallothion