鵝細(xì)小病毒VP2基因與鵝IL-2融合基因的構(gòu)建.pdf

1、小鵝瘟是鵝細(xì)小病毒(GPV)感染的一種傳播快、死亡率高的高度接觸性傳染病，以滲出性腸炎、肝、腎、心等實(shí)質(zhì)器官炎癥為特征，對(duì)5-13日齡的雛鵝發(fā)病率和死亡率可達(dá)100％，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要疾病之一。近年來(lái)，本病在世界各地均有不同程度的流行，廣泛發(fā)生于中國(guó)、歐洲各國(guó)、以色列、越南和日本等地。目前，用于防治該病的疫苗主要為弱毒苗和油乳劑滅活苗。弱毒苗價(jià)格低、效果好，但易導(dǎo)致病毒散播；滅活苗雖然安全，又能激發(fā)良好的體液免疫反應(yīng)，但不足之處是

2、使用劑量大，且不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，而一系列的研究證實(shí)在疾病的免疫保護(hù)中，細(xì)胞免疫和體液免疫均占有重要的地位。核酸疫苗的出現(xiàn)給小鵝瘟的免疫預(yù)防帶來(lái)了新的希望，但研究也發(fā)現(xiàn)核酸疫苗也存在許多不足之處：如免疫原性不強(qiáng)、質(zhì)粒DNA可能整合到宿主DNA上引起病理和毒理反應(yīng)等。因此，如何增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果成為目前該疫苗研究的關(guān)鍵。隨著人們對(duì)IL-2等細(xì)胞因子的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的分子佐劑效應(yīng)，能特異性增強(qiáng)抗原的免疫原性或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗

3、原的反應(yīng)性。 VP2是鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白之一，是GPV的重要保護(hù)性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，與主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3存在相同的抗原決定簇，是制備核酸疫苗的重要候選基因。本試驗(yàn)參考GenBank發(fā)表的GPV—B株全基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR方法擴(kuò)增出GPV病毒的VP2基因，然后與鵝源性白細(xì)胞介索-2基因(Goose Interleukin-2)構(gòu)建成融合基因VP2-IL-2，將該融合基因克隆到真核表達(dá)載體pCDNA3.

4、1(+)中，構(gòu)建出pCDNA3.1(+)—VP2-IL-2重組質(zhì)粒，最后將構(gòu)建的核酸疫苗免疫小白鼠，比較其誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫發(fā)生能力的差異，以期探討IL-2對(duì)GPV核酸疫苗是否有免疫增強(qiáng)作用。并為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)小鵝瘟DNA疫苗提供科學(xué)依據(jù)。 1．重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)—VP2的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank公布的鵝細(xì)小病毒(GPV)GPV—B株全基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位點(diǎn)、

5、下游引入XhoⅠ位點(diǎn)。以鵝細(xì)小病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增出VP2完整基因。再與pMD18—T質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5a，提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定為陽(yáng)性克隆后，與真核表達(dá)載體相連，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)—VP2。 2．重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)—VP2-IL-2的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank公布的鵝細(xì)小病毒(GPV)GPV—B株全基因序列和鵝源性白細(xì)胞介素-2(IL-2)基因序列

6、分別設(shè)計(jì)特異性引物，且在GPV VP2基因引物上游引入BamHⅠ位點(diǎn)、下游引入SalⅠ位點(diǎn)，在IL-2基因引物上游引入SalⅠ位點(diǎn)、下游引入XhoⅠ、HindⅢ位點(diǎn)．先RT—PCR擴(kuò)增上游帶有SalⅠ位點(diǎn)、下游帶有XhoⅠ、HindⅢ位點(diǎn)的鵝源IL-2基因，并將其克隆到pMD18—T中。再以鵝細(xì)小病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增VP2基因。將其插入到含有IL-2基因的質(zhì)粒pMD18T—IL-2中，使兩個(gè)基因首尾相連，且VP2基因不含終止密碼

7、子，IL-2基因不含起始密碼子。最后將VP2-IL-2融合基因插入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)—VP2-IL-2。 3．小白鼠免疫試驗(yàn) 我們將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，分別為：pCDNA3.1(+)—VP2-IL-2核酸疫苗組(Ⅰ組)、pCDNA3.1(+)—VP2核酸疫苗組(Ⅱ組)、GPV弱毒疫苗組(Ⅲ組)、空載體pCDNA3.1(+)組(Ⅳ組)、空白對(duì)照組(滅菌生理鹽

8、水)(Ⅴ組)．接種途徑為肌肉注射(100ug/只)，首免后間隔14天進(jìn)行第二次免疫，二免后兩周進(jìn)行第三次免疫，三免后兩周，放血分離血清。通過(guò)間接ELISA檢測(cè)，比較其誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫發(fā)生能力的差異。其結(jié)果為：核酸疫苗誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫的能力總體較GPV弱毒疫苗強(qiáng)。一免后，核酸疫苗免疫組(Ⅰ、Ⅱ)IL-4、IFN—γ水平均顯著極差異(P＜0.01)高于GPV弱毒疫苗組(Ⅲ組)，GPV弱毒疫苗組(Ⅲ組)顯著極差異(P＜0.01)高于空