水稻早衰突變體es7和pls5基因的圖位克隆與功能研究.pdf

1、本研究從實驗室的突變體庫中，篩選得到兩個早衰突變體，分別命名為es7和pls5。隨后分別對其開展了表型分析、基因定位與克隆、基因功能分析等相關(guān)工作，獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.通過60Co輻射誘變93-11種子，篩選得到一個水稻早衰突變體es7。在大田種植條件下，播種60天左右時，下部葉片開始出現(xiàn)衰老，隨著植株的生長發(fā)育，衰老越來越嚴(yán)重。在高濃度二氧化碳條件下，光呼吸被抑制，es7表型可以得到恢復(fù)。生理指標(biāo)檢測分析發(fā)現(xiàn)，es7突

2、變體中，有大量H2O2積累，并且過氧化氫酶活性顯著降低，植株總抗氧化能力降低;同時衰老相關(guān)基因表達(dá)量都顯著升高。圖位克隆和測序分析發(fā)現(xiàn)，在88kb范圍內(nèi)，第9個ORF（LOC_Os07g46460）的第二個外顯子和內(nèi)含子銜接處(1292bp)，有一個堿基發(fā)生了突變，由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致mRNA缺失57個堿基，最終導(dǎo)致蛋白保守的purF-type谷氨酰胺轉(zhuǎn)移區(qū)域結(jié)構(gòu)異常。
　　ES7基因編碼一個鐵氧還原蛋白依賴的谷氨酸合酶(Fd-GO

3、GAT)，是一個組成型表達(dá)的基因，并且其編碼的蛋白定位于葉綠體。熒光定量PCR分析顯示，在es7突變體中，很多氮代謝相關(guān)的基因表達(dá)量和酶活性都發(fā)生了改變，大部分游離氨基酸含量也顯著降低;并且葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)量也都顯著降低。另外，當(dāng)幼苗生長在濃度逐漸增加的NH4+條件下，葉綠素的含量依然顯著低于野生型。我們的研究結(jié)果表明，F(xiàn)d-GOGAT突變導(dǎo)致es7的早衰表型，該基因參與氮代謝，影響葉綠素的合成，并且可能參與光呼吸過程，最終影響葉

4、片衰老。
　　2.通過EMS誘變中恢8015(ZH8015)種子，篩選得到一個早衰突變體pls5。在播種60天左右，從pls5突變體下部葉片葉尖開始，出現(xiàn)黃化衰老干枯。隨著植株的生長發(fā)育，衰老葉片的數(shù)量、衰老的程度都逐漸增加。到抽穗期時，衰老程度已經(jīng)很嚴(yán)重，除劍葉葉片，其他葉片的中上部都已經(jīng)明顯的衰老干枯。到灌漿期，幾乎整個植株都已經(jīng)衰老干枯。pls5突變體葉綠素含量顯著降低，光合作用降低，農(nóng)藝相關(guān)性狀受到影響，使單株產(chǎn)量顯著降低

5、。DAB、依文思藍(lán)染色、TUNEL實驗以及生理指標(biāo)檢測顯示，pls5突變體中有過量H2O2積累，過氧化物酶活性降低，細(xì)胞死亡增加。葉片透射電鏡觀察顯示，pls5突變體葉綠體結(jié)構(gòu)異常，葉綠體降解加速。
　　遺傳分析表明，pls5早衰表型是由一個核隱性單基因控制。利用圖位克隆的方法，將該基因定位于5號染色體69.3kb范圍內(nèi)，包含12個開放閱讀框。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，在第七個開放閱讀框LOC_Os05g48060內(nèi)，在633-643位置缺

6、失11個堿基，最終導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。該基因編碼一個磷脂酰絲氨酸合酶，即OsPSS2(SUI2)。轉(zhuǎn)基因遺傳互補、RNAi等表明，pls5突變體的表型是由OsPSS2突變引起的。進(jìn)化分析顯示，該基因在不同的物種中同源性和保守性都很高。PLS5在水稻中組成型表達(dá)，并且在沒有衰老的葉片中表達(dá)量較高;PLS5蛋白定位于細(xì)胞膜和核膜。葉綠素合成、降解以及光合作用相關(guān)基因表達(dá)量分析顯示，pls5突變體葉綠素合成受阻，葉綠體降解加速。同時，離體和