低溫脅迫下番茄紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的表達(dá)和功能研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文低溫脅迫下番茄紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的表達(dá)和功能研究姓名：韓菡申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：孟慶偉20090601低溫脅迫下番茄紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因的表達(dá)和功能研究集區(qū)，有活性的VDE中N一端含有1113個(gè)半胱氨酸，是VDE的抑制劑DTT作用的區(qū)域，低濃度DTT只能部分抑制VDE的活性，說明N端的半胱氨酸形成不止一個(gè)二硫鍵。blockII為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白特征區(qū)，結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)疏水小分子的區(qū)域，為疏水底物A和Z的

2、結(jié)合區(qū)。blockIII是C端谷氨酸富集區(qū)，含有大量的負(fù)電荷，是VDE與類囊體膜結(jié)合的部位。2Northern雜交結(jié)果表明，LeVDE基因呈非特異性表達(dá)，在葉綠素含量高的組織中表達(dá)量較高。同時(shí)，該基因在弱光和強(qiáng)光處理的24小時(shí)晝夜周期中都存在著相似的雙峰表達(dá)模式，并部分受低溫的抑制。Southern雜交結(jié)果表明，LeVDE基因在番茄基因組中是單拷貝的。3將獲得的LeVDE基因與含有35S啟動(dòng)子的pBll21載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義

3、表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，用PCR及Northern雜交的方法對(duì)帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比，過量表達(dá)LeVDE基因的番茄葉片中A和z的含量增加，而V的含量減少，脫環(huán)氧化狀態(tài)較野生型高。LeVDE基因表達(dá)受到抑制的番茄植株中V量積累，而A和Z含量非常低，脫壞氧化狀態(tài)保持較低的水平4構(gòu)建了原核表達(dá)載體pETLeVDE，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋

4、白，將強(qiáng)誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效價(jià)為1：500。Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義植株中LeVDE基因已在蛋白水平過量表達(dá)。另外，分別對(duì)低溫弱光和強(qiáng)光處理的野生型番茄進(jìn)行了Western雜交分析。結(jié)果表明，LeVDE在蛋白水平的表達(dá)始終處在穩(wěn)定的水平，基本不受光強(qiáng)和溫度的影響。5在低溫弱光(4℃，100gmolm之S‘1)和強(qiáng)光(1200gmolm～s。)脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)正義基因株系Tl一7和Tl—lO株

5、系的NPQ及葉黃素循環(huán)脫環(huán)氧化狀態(tài)(AZ)／(VAZ)都增加，但野生型的增加更為明顯。在低溫弱光及強(qiáng)光脅迫條件下，依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過剩激發(fā)能，而轉(zhuǎn)基因株系比野生型耗散能力加強(qiáng)。強(qiáng)光處理過程中，野生型比轉(zhuǎn)正義基因株系的Fv／Fm降低更明顯，且轉(zhuǎn)基因株系的Fv／Fm恢復(fù)較快，野生型的Fv／Fm恢復(fù)較慢。與在強(qiáng)光下類似，Tl一7和T110株系的Fv／Fm在低溫脅迫過程中降低的程度比野生型小，而恢復(fù)較慢。這表明LeVDE的過量表達(dá)