家蠶磷酸吡哆醇氧化酶的基因表達(dá)分析.pdf

1、維生素B6(VB6)是一種水溶性維生素，游離型為吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxamine，PM)和吡哆醛(Pyridoxal，PL)，相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式，除參加催化涉及

2、氨基酸代謝的各種反應(yīng)外，還與細(xì)胞其他多種生理活動(dòng)有關(guān)。植物和微生物可以從頭合成(de novo pathway)PLP，而動(dòng)物則需要從外界攝取VB6 通過補(bǔ)救途徑(Salvage pathway)合成PLP。在PLP 補(bǔ)救合成途徑中，磷酸吡哆醇氧化酶(Pyridoxine-5’-phosphate oxidase，PNPO)發(fā)揮重要作用。在黃素單核苷酸(FMN)和O2 存在下，氧化底物PNP和PMP，生成PLP。
　　 家蠶(B

3、ombyx mori，B.mori)既是僅次于果蠅作為昆蟲研究的模式生物，也是支撐蠶絲業(yè)的生物基礎(chǔ)。家蠶在合成絲蛋白和生長發(fā)育時(shí)，體內(nèi)氨基酸的合成代謝非?；钴S，其中VB6 代謝是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。PNPO在家蠶體內(nèi)VB6的轉(zhuǎn)換代謝中可能是一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室前期采用生物信息學(xué)原理和PCR方法，構(gòu)建家蠶PNPO 融合基因表達(dá)質(zhì)粒pET22b-His-PNPO，原核表達(dá)純化出重組蛋白，并且初步分析了家蠶PNPO的酶學(xué)性質(zhì)，

4、對其蛋白結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了預(yù)測。
　　 本實(shí)驗(yàn)將家蠶PNPO基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)-PNPO 轉(zhuǎn)化入Escherichia coli Rosetta中經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，獲得融合蛋白，經(jīng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE，以切膠的方式免疫家兔獲得抗血清。以家蠶5齡幼蟲的精巢、頭、腸、馬氏管、卵巢、表皮、脂肪體、絲腺8個(gè)組織為實(shí)驗(yàn)材料制備粗蛋白提取液，進(jìn)行Western blot，分析PNPO在家蠶不

5、同組織中的表達(dá)情況。
　　 同時(shí)，提取上述8個(gè)組織的總RNA。分別設(shè)計(jì)家蠶PNPO基因和內(nèi)參18S rRNA的特異性引物。采用熒光定量PCR，分析PNPO基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況。
　　 本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的PNPO以包涵體的形式表達(dá)且制備的多克隆抗體對重組蛋白具有良好的特異性。通過Western blot和熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)PNPO基因在家蠶5齡幼蟲各組織中的轉(zhuǎn)錄由高到低依次為精巢、頭、腸、馬氏管、卵巢、表皮、脂肪體、絲腺