魔芋多酚氧化酶基因的克隆與序列分析.pdf

1、魔芋乃天南星科魔芋屬多年生草本植物，在我國西南山區(qū)具有悠久的栽培歷史。其地下球莖富含葡甘聚糖，因其特殊的理化性質(zhì)，對高血壓、糖尿病、肥胖、便秘等有預(yù)防與輔助治療作用，同時在化工、環(huán)保、建筑等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景。
　　魔芋球莖含水量高，在種芋運(yùn)輸過程中極易碰傷而產(chǎn)生褐變，影響種芋質(zhì)量，從而影響產(chǎn)量。球莖在加工成魔芋粉的過程中，去皮和切片使細(xì)胞組成物質(zhì)在酶的作用下發(fā)生褐變，影響魔芋粉的品質(zhì)。因此，控制魔芋的酶促褐變是生產(chǎn)和加工亟待

2、解決的問題。
　　研究發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶(PPO)是導(dǎo)致魔芋褐變的關(guān)鍵酶之一。本研究先采用同源克隆的方法，從花魔芋葉片中克隆得到PPO基因的保守編碼區(qū)序列，并采用RT-PCR、RACE技術(shù)從花魔芋葉片中克隆得到PPO基因全長，以期掌握魔芋PPO基因的序列信息及其遺傳背景，為通過轉(zhuǎn)基因方法調(diào)控PPO基因表達(dá)，獲得抗酶促褐變的新品種提供理論基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、魔芋基因組DNA、不同組織的RNA提取與純化方法的優(yōu)化

3、r>　　魔芋gDNA提取，CTAB提取緩沖液成分為:2％(W/V)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/LEDTA、1％PVP(W/V)，并加入β-巰基乙醇使終濃度為0.2％，樣品迅速碾磨成粉末狀溶解于提取液后，氯仿抽提兩次，異丙醇和NaAC(3mol/L，pH5.2)使DNA沉淀，75％無水乙醇洗滌雜質(zhì)2～3次，無水乙醇脫水，加雙蒸水溶解沉淀得到DNA樣品，-20℃保存?zhèn)?/p>

4、用。改良CTAB法能有效去除魔芋中的多糖、多酚等雜質(zhì)污染，獲得完整、純凈的DNA樣品，可用于后續(xù)分子標(biāo)記、資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究。
　　魔芋不同組織RNA提取，CTAB提取緩沖液主要成分為:2％(W/V)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mol/L NaCl、25mmol/LEDTA、2％PVP(W/V)、0.5g/L亞精胺，并加入β-巰基乙醇使終濃度為0.5％，樣品迅速碾磨成粉末狀溶解于提取液后

5、，氯仿抽提兩次，在RNA粗提取液中加入冷無水乙醇，吹打混勻后加至試劑盒自帶的吸附柱中，加BufferRW1后離心，加Buffer RW2后離心，用Rnase-free H2O溶解得到RNA樣品，-80℃保存?zhèn)溆?。CTAB試劑盒相結(jié)合法，可有效去除魔芋中的多糖、多酚等雜質(zhì)，獲得完整、純凈的RNA樣品，可直接用于后續(xù)的分子生物學(xué)操作（如半定量分析、RACE反應(yīng)等）。
　　2、采用同源克隆和RACE技術(shù)得到花魔芋PPO基因全長序列

6、>　　分別以花魔芋葉片gDNA和cDNA第一鏈為模板，用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該DNA和cDNA片段長度均為763bp，二者核苷酸序列相同，在保守區(qū)內(nèi)無內(nèi)含子，翻譯254個氨基酸殘基。再利用5'RACE、3'RACE技術(shù)從花魔芋葉片中分別克隆得到5'端和3'端序列，拼接獲得魔芋PPO基因全長序列，其cDNA全長2026 bp，完整的編碼框?yàn)?452 bp，編碼484個氨基酸，5'端有384bp非編碼區(qū)，3'端有190bp非編碼區(qū)。

7、
　　核苷酸序列比對結(jié)果表明，魔芋PPO基因編碼區(qū)序列與禾本科小麥(NCBI登錄號:HQ228149.1)的相似度最高，達(dá)84％，與水稻(NCBI登錄號:DQ532414.1)PPO的相似度達(dá)77％，與甘薯(NCBI登錄號:AY822711.1)、馬鈴薯(NCBI登錄號:U22922.1)PPO的相似度分別為76％、79％，與薔薇科植物的相似度在74％-76％之間。編碼區(qū)氨基酸序列比對結(jié)果顯示，魔芋與鳳梨科菠蘿(GenBank登錄

8、號:AAO16865.1)、睡蓮科中國蓮(GenBank登錄號:ADP89908.1)、禾本科小麥(GenBank登錄號:HQ228149.1)、薔薇科蘋果(GenBank登錄號:BAA21676.1)等植物相似度分別為68％、63％、61％、59％。
　　3、魔芋PPO基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析
　　采用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，魔芋PPO蛋白分子量約為55kD，pI為9.32，編碼蛋白屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，具有PPO蛋白典型的特