煙草和棉花中交替氧化酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、植物線粒體呼吸鏈中除細(xì)胞色素途徑外，還存在一條對(duì)氰化物不敏感的呼吸途徑即抗氰呼吸途徑。電子從泛醌庫(kù)直接傳遞給交替氧化酶(alternativeoxidase，AOX)，然后氧化生成水，放出熱量。關(guān)于抗氰呼吸途徑和AOX基因的生物學(xué)功能一直是植物生理學(xué)領(lǐng)域中研究的熱門課題，除在一些植物(如天南星科植物)開花過程中產(chǎn)熱(有利于傳粉)外，AOX的其它生物學(xué)功能還未定論。本研究從三生煙草中克隆了交替氧化酶基因(XtAOX1)，研究了不同誘導(dǎo)條件

2、下XtAOX1的表達(dá)特點(diǎn)。構(gòu)建了含XtAOX1基因的3種植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化三生煙草，獲得了不同XtAOX1表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因株系的T。代植株進(jìn)行了生物學(xué)功能分析。同時(shí)，我們還以棉花為材料，克隆了棉花交替氧化酶基因(GhAO；X1)，比較了氨基酸序列，并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了分析。具體結(jié)果如下：1.根據(jù)已報(bào)道的AOX1基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR的方法，從三生煙草中克隆了交替氧化酶基因(

3、XtAOX1)，cDNA大小為1071bp。 2.以XtAOX1cDNA核苷酸片段制備探針，采用Northern雜交的方法對(duì)野生三生煙草中XtAOX1的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，XtAOX1受水楊酸(SA)、氰化鉀(KCN)、煙草花葉病毒(TMV)誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)XtAOX1的表達(dá)還具有組織特異性，在根中的表達(dá)量最高，花中其次，葉中最少。 3.構(gòu)建了3種植物表達(dá)載體，即含反義XtAOX1的載體pBI-T-AOX，含正義

4、XtAOX1的載體pBI-AOX，以及含有增強(qiáng)表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合序列(MARs)的正義XtAOX1的載體pBI—M—AOX。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將3種載體分別轉(zhuǎn)化三生煙草，同時(shí)以轉(zhuǎn)空的載體為對(duì)照，獲得4種不同類型的轉(zhuǎn)基因三生煙草植株。 4.轉(zhuǎn)不同載體的轉(zhuǎn)基因煙草當(dāng)代(T0代)所結(jié)的種子，經(jīng)卡那霉素篩選，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因株系的T。代植株P(guān)CR鑒定結(jié)果，初步證明在被測(cè)試的轉(zhuǎn)基因株系中，轉(zhuǎn)基因在T。代中的遺傳基本符合3：1的分離規(guī)律。

5、 5.在分子鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)T。代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了生物學(xué)功能分析。抗鹽實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在0.2MNaCl溶液中，轉(zhuǎn)反義XtAOX1基因的轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照植株及其它轉(zhuǎn)基因植株有較強(qiáng)的抗性；抗真菌實(shí)驗(yàn)中，接種了赤星病原菌(A1ternariaa1ternata)的不同的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)赤星病菌的發(fā)病情況相似，病斑大小基本一致，表明XtAOX1基因在抗真菌方面作用不大；抗煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus，TMV)檢測(cè)的結(jié)果表明

6、，轉(zhuǎn)反義XtAOX1基因的轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗病性，表明XtAOX1基因與植物的煙草花葉病毒抗性有負(fù)相關(guān)作用。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)部分正義轉(zhuǎn)基因煙草植株發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化，初步推測(cè)交替氧化酶可能在植物的發(fā)育方面起到一定作用。 6.以棉花(魯棉22)為材料，采用RT-PCR和RACE的方法，首次從棉花中克隆了交替氧化酶基因(GhAOX1)，并注冊(cè)GenBank，注冊(cè)號(hào)為DQ250028。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)為996bp，編碼含33