西瓜線粒體交替氧化酶基因的克隆及交替呼吸途徑對(duì)西瓜低溫抗性的調(diào)控.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus)是廣受世界各地人們所喜愛的水果之一，然而作為冷敏感型的植物，在其早期的栽培中常常受到冷害的影響，嚴(yán)重限制其產(chǎn)量。很多研究表明交替呼吸途徑在植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性中起到非常重要的作用。為了研究低溫脅迫條件下交替呼吸途徑對(duì)西瓜抗性的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)通過抑制性差減雜交的方法構(gòu)建了低溫(10℃)脅迫下抗低溫西瓜種質(zhì)IVSM9在交替呼吸途徑被抑制后的下調(diào)表達(dá)基因文庫。
　　 低溫(10℃)2

2、4小時(shí)后，可明顯看到SHAM(線粒體交替呼吸途徑抑制劑)預(yù)處理的植株同水處理植株相比表現(xiàn)出明顯的冷害性狀。通過測定對(duì)照和SHAM處理植株的總呼吸和交替呼吸強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，2 mM SHAM可以顯著地抑制大約55％的交替呼吸強(qiáng)度。因此，抑制交替呼吸途徑可以顯著降低西瓜的抗冷性。
　　 運(yùn)用抑制性差減雜交(SSH)的方法，我們以正常植株作為tester，以SHAM處理植株作為driver，構(gòu)建了一個(gè)含有500個(gè)克隆的差減文庫。從中挑選出4

3、00個(gè)陽性克隆，并全部進(jìn)行測序。對(duì)測得的序列進(jìn)行cluster分析，得到低溫下SHAM處理后下調(diào)表達(dá)的非重復(fù)基因片段314條。通過在Arabidopsis Information Resource(TAIR)上進(jìn)行BLASTN和BLASTX分析，發(fā)現(xiàn)有30條編碼未知蛋白，94條沒有任何的同源性，其余一些具有顯著同源性的基因，根據(jù)其編碼蛋白的功能，主要參與能量和代謝過程、脅迫和抗性反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白命運(yùn)、蛋白合成、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及

4、其它一些細(xì)胞生物學(xué)功能。這些基因分布于植物細(xì)胞中的各個(gè)組成部分，表明交替呼吸途徑可以對(duì)細(xì)胞線粒體外的環(huán)境產(chǎn)生深刻的影響?？偟膩碚f，這些結(jié)果說明西瓜線粒體交替呼吸途徑在調(diào)控植物的低溫脅迫反應(yīng)上發(fā)揮重要的作用，它可以在各種生物化學(xué)和分子生物學(xué)途徑上影響植物的低溫脅迫反應(yīng)。
　　 為了進(jìn)一步的驗(yàn)證差減雜交結(jié)果的可靠性。我們從差減文庫中選出一些基因，分別選取低溫處理后0、6、12、24、48小時(shí)的植株進(jìn)行熒光定量PCR分析，研究這些基因

5、在SHAM處理和對(duì)照植株間的差異表達(dá)情況。常溫條件下，SHAM處理同對(duì)照相比會(huì)誘導(dǎo)一些基因的表達(dá)；低溫條件下，這些基因均被低溫不同程度的誘導(dǎo)，表達(dá)倍數(shù)在幾十甚至幾百之間，表明這些基因均對(duì)低溫脅迫呈現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。但同對(duì)照相比，SHAM處理后這些基因的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢，有些基因在前6個(gè)小時(shí)或12小時(shí)在SHAM處理植株中表達(dá)高于對(duì)照；而有些基因在整個(gè)低溫的過程，在SHAM處理植株中表達(dá)始終低于對(duì)照。各種各樣的參與各種細(xì)胞生命活動(dòng)的基因

6、在SHAM處理和對(duì)照植株之間，以及相同處理植株的不同時(shí)間點(diǎn)之間，均表現(xiàn)出各種各樣不同的動(dòng)態(tài)變化模式，這表明不同的細(xì)胞生命活動(dòng)在低溫下都將會(huì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以適應(yīng)低溫環(huán)境，提高植物的低溫抗性。交替呼吸途徑被抑制后這些基因的表達(dá)同樣呈現(xiàn)出各種不同的變化模式，但在最初的動(dòng)態(tài)變化和調(diào)整后，這些基因均在12或24小時(shí)后表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)的趨勢。因此，SHAM處理可以顯著抑制一些基因的表達(dá)。
　　 同時(shí)我們克隆到了西瓜交替氧化酶AOX2基因，對(duì)

7、其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)它同許多交替氧化酶基因一樣，存在很多保守的功能位點(diǎn)；組織表達(dá)和低溫表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，它并不對(duì)低溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，但是可能在西瓜果實(shí)成熟的過程中發(fā)揮作用。
　　 此外，我們從差減文庫中發(fā)現(xiàn)許多未知的cDNA，并且克隆到了一個(gè)編碼未知蛋白的基因。它可能是一條受交替呼吸途徑調(diào)控的低溫誘導(dǎo)新基因。對(duì)這條新基因的研究不僅有助于我們了解西瓜對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，同時(shí)對(duì)于我們研究西瓜線粒體交替呼吸途徑通過反向