心葉煙交替氧化酶基因(NgAOX1a)的分離及其表達(dá)特性分析.pdf

1、植物線粒體區(qū)別于動(dòng)物線粒體的重要特征之一是植物線粒體具有一條對氰化物不敏感的電子傳遞途徑，即抗氰呼吸途徑(cyanide-resistantrespiration pathway)或稱對氰化物不敏感的交替氧化途徑(cyanide-insensitive alternative pathway，AP)。電子流通過細(xì)胞色素途徑，偶聯(lián)ATP的生成，而電子在細(xì)胞色素途徑的泛醌處分支，轉(zhuǎn)入交替氧化途徑，結(jié)合氧氣，生成水。該過程并植物線粒體區(qū)別于動(dòng)

2、物線粒體的重要特征之一是植物線粒體具有一條對氰化物不敏感的電子傳遞途徑，即抗氰呼吸途徑(cyanide-resistantrespiration pathway)或稱對氰化物不敏感的交替氧化途徑(cyanide-insensitive alternative pathway，AP)。電子流通過細(xì)胞色素途徑，偶聯(lián)ATP的生成，而電子在細(xì)胞色素途徑的泛醌處分支，轉(zhuǎn)入交替氧化途徑，結(jié)合氧氣，生成水。該過程并不生成ATP，而是釋放熱量，由交替氧

3、化酶(alternative oxidase，AOX)所介導(dǎo)。AOX是交替氧化途徑的末端氧化酶，位于線粒體的內(nèi)膜上。在已檢測的物種中，大部分植物組織中都含有AOX蛋白。 關(guān)于交替氧化途徑和AOX的生物學(xué)功能一直是植物生理學(xué)領(lǐng)域中研究的熱門課題，除在一些植物(如天南星科植物)開花過程中產(chǎn)熱(有利于傳粉)外，AOX蛋白的三級結(jié)構(gòu)及很多生物學(xué)功能都不是很清楚。本研究從心葉煙中克隆了交替氧化酶基因(NgAOX1a)，對其進(jìn)行了序列比對、

4、表達(dá)特性分析。同時(shí)，還克隆了NgAOX1a基因的啟動(dòng)子，構(gòu)建了缺失分析的表達(dá)載體，為下一步分析啟動(dòng)子元件奠定了基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下： 1、利用反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)從心葉煙(Nicotiana glutinosa)中分離得到一個(gè)AOX基因，即NgAOX1a，GenBank注冊號為EF523518。該基因cDNA全長1448bp，包括一個(gè)1062 bp的開放閱讀框(ORF)，124 bp的5'非編碼區(qū)(untranslate

5、d region，UTR)和262 bp的3'UTR。ORF編碼一個(gè)353氨基酸的多肽，包括2個(gè)保守的半胱氨酸殘基、4個(gè)Fe結(jié)合位點(diǎn)、5個(gè)α-螺旋區(qū)和6個(gè)保守的組氨酸殘基。序列分析發(fā)現(xiàn)NgAOX1a與其他物種中的AOX1基因有較高的同源性。NgAOX1a的基因組含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，Southern雜交顯示NgAOX1a基因?yàn)閱慰截惢颉?2、Northern雜交分析顯示NgAOX1a基因可以被各種非生物脅迫條件強(qiáng)烈誘導(dǎo)，

6、如響應(yīng)防御反應(yīng)的外源信號分子水楊酸(salicylic acid，SA)和H2O2、外源的三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)中間代謝物檸檬酸鹽，但被乙烯(ethylene，ET)的抑制劑COCl2抑制表達(dá)。此外，NgAOX1a基因還可以被煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)強(qiáng)烈

7、誘導(dǎo)。根據(jù)這些結(jié)果，可以推測NgAOX1a可能參與多個(gè)信號傳導(dǎo)途徑，并在防御反應(yīng)中起一定的作用。 3、用NgAOX1a構(gòu)建正義植物表達(dá)載體pBI121-NgAOX1a，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化煙草(NC89)，經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)空載體的植株作為對照。經(jīng)過PCR鑒定及半定量RT-PCR分析，證明NgAOX1a在轉(zhuǎn)基因煙草中得到成功表達(dá)。 4、選取T0代轉(zhuǎn)基因株系的自交種子擴(kuò)繁，得到T1代轉(zhuǎn)基因植株。在

8、分子鑒定的基礎(chǔ)上，初步證明所測試的正義轉(zhuǎn)基因株系在T1代中的遺傳基本符合3:1的分離規(guī)律。 5、通過LA PCR和反向PCR的方法獲得NgAOX1基因的啟動(dòng)子序列，GenBank注冊號為GQ199607。利用分析軟件PlantCARE對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列除了存在典型的TATA box和CAAT box外，還存在SA響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、真菌響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件等一系列可能的誘導(dǎo)調(diào)控元件。 6、用NgAOX1a的啟動(dòng)