桔小實蠅酚氧化酶酶學(xué)特性及其酶原基因的研究.pdf

1、酚氧化酶在昆蟲的生長發(fā)育和變態(tài)過程中具有重要作用，該酶主要參與昆蟲傷口愈合、黑化作用和硬化作用。其中，黑化與硬化在昆蟲表皮的形成、抵御外源病原菌以及免疫反應(yīng)中起到重要的作用。因此，酚氧化酶及其酶原蛋白成為昆蟲生長發(fā)育與免疫反應(yīng)研究的熱點(diǎn)。桔小實蠅是一種極具破壞力的多食性害蟲，可危害250多種果蔬?；己陀鸹抢ハx在生長發(fā)育過程中，面臨復(fù)雜環(huán)境而成功生存繁衍的重要變態(tài)過程。桔小實蠅成蟲產(chǎn)卵于果實中，幼蟲期主要在果實內(nèi)部為害，造成果實腐爛落

2、地，進(jìn)而在土壤中化蛹羽化為成蟲后繼續(xù)為害。當(dāng)前，對桔小實蠅的防治主要依靠化學(xué)藥劑，導(dǎo)致桔小實蠅對多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生了抗性，所以尋找新方法新途徑進(jìn)行治理已刻不容緩。本學(xué)位論文研究以桔小實蠅為對象，以酚氧化酶及其酶原為靶標(biāo)，針對桔小實蠅幼蟲-蛹變態(tài)階段該酶的作用開展了系統(tǒng)而深入地研究，主要結(jié)果如下:
　　1.桔小實蠅不同發(fā)育階段及組織中酚氧化酶酶學(xué)特性及其酶原基因表達(dá)模式
　　以鄰苯二酚為底物，分別測定桔小實蠅不同發(fā)育階段酚氧化酶

3、活力。結(jié)果表明:桔小實蠅在不同發(fā)育階段酚氧化酶活力的高低存在顯著性差異，其中3齡幼蟲的酶活力最高，1齡幼蟲的酶活力最低。測定桔小實蠅3齡幼蟲表皮、脂肪體和中腸等組織的酚氧化酶活力，結(jié)果表明:桔小實蠅表皮、脂肪體和中腸等組織均可檢測到酚氧化酶的活性。其中表皮中酚氧化酶活力最高，而脂肪體中酚氧化酶活力最低。
　　分析桔小實蠅酚氧化酶的動力學(xué)常數(shù)發(fā)現(xiàn)，以鄰苯二酚為底物時，桔小實蠅不同發(fā)育階段間酚氧化酶的米氏常數(shù)(Km)值差異顯著，1齡、

4、2齡幼蟲中酚氧化酶的最大反應(yīng)速度(Vmax)值顯著大于3齡幼蟲、蛹和成蟲的Vmax。以L-多巴為底物結(jié)果大致相同。桔小實蠅不同組織間酚氧化酶的Km值無顯著性差異，表皮酚氧化酶的Vmax值顯著高于脂肪體和中腸酚氧化酶的Vmax值;但以L-多巴為底物時，各組織酚氧化酶的Km和Vmax均無顯著性差異。桔小實蠅不同發(fā)育階段及組織中酚氧化酶酶促反應(yīng)的最適pH為7.5，溫度為37℃。
　　采用qPCR技術(shù)，以α-Tubulin為內(nèi)參基因，解析

5、桔小實蠅酚氧化酶酶原基因(BdPPO1)在不同發(fā)育階段及組織的表達(dá)模式。結(jié)果表明，BdPPO1主要在桔小實蠅幼蟲-蛹轉(zhuǎn)化期以及表皮中表達(dá)量較高，說明酚氧化酶活力及BdPPO1表達(dá)量與桔小實蠅生長發(fā)育緊密相關(guān)，尤其是在其變態(tài)發(fā)育階段。
　　2.曲酸對桔小實蠅酚氧化酶及生長發(fā)育的影響
　　曲酸是酚氧化酶的典型抑制劑，能夠有效的抑制昆蟲酚氧化酶的活性。將曲酸加入到桔小實蠅人工飼料并喂食新孵化的幼蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅幼蟲期和蛹期顯

6、著延長，化蛹率和羽化率顯著降低，幼蟲體態(tài)明顯小于對照組。
　　以鄰苯二酚為底物，喂食曲酸飼料的桔小實蠅幼蟲體內(nèi)及表皮中酚氧化酶酶活力顯著降低，而BdPPO1基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測桔小實蠅體內(nèi)可能存在一種自我補(bǔ)償機(jī)制。進(jìn)一步分析酚氧化酶動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，飼喂曲酸后酚氧化酶的Km值未發(fā)生顯著變化，但Vmax值顯著降低，酶促反應(yīng)的最適pH和溫度未發(fā)生變化。上述結(jié)果說明曲酸能夠有效抑制桔小實蠅酚氧化酶的活性，并且導(dǎo)致桔小實蠅生長發(fā)育延遲。

7、r>　　3.20-羥基蛻皮酮(20E)及金屬離子對桔小實蠅BdPPO1表達(dá)量的影響
　　對桔小實蠅3齡幼蟲注射20E后，發(fā)現(xiàn)桔小實蠅幼蟲提前化蛹。檢測注射不同濃度的20E后BdPPO1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與對照相比，注射濃度為0.5μg/mL時該基因表達(dá)量顯著上調(diào)，而注射濃度降低或提高至0.1μg/mL和1μg/mL時該基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。
　　離體酶活性測定發(fā)現(xiàn)，Zn2+、Mg2+、Ca2+和Cu2+等4種二價金屬離子均能有效

8、地激活并提高桔小實蠅酚氧化酶的活力。向新孵化幼蟲飼喂含金屬離子的人工飼料6d后，酚氧化酶活力顯著升高，其中飼喂鋅離子后酚氧化酶活力最高，而飼喂鎂離子后酚氧化酶活力最低。進(jìn)一步采用qPCR技術(shù)檢測桔小實蠅BdPPO1表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，飼喂4種金屬離子后該基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。上述結(jié)果說明，桔小實蠅BdPPO1表達(dá)量受20E調(diào)控，酚氧化酶作為一種金屬酶，能夠有效的被金屬離子激活。
　　4.桔小實蠅BdPPO1基因的功能驗證
　　利用