野桑蠶等酚氧化酶的生化特性、基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、酚氧化酶(Phenol Oxidase,簡(jiǎn)稱PO，在哺乳動(dòng)物中稱為酪氨酸酶)廣泛存在于生物體內(nèi)，它是昆蟲(chóng)生命活動(dòng)中的重要調(diào)節(jié)酶，在昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。酚氧化酶催化完成的“醌鞣化”作用可以促進(jìn)昆蟲(chóng)表皮的硬化與黑化，這個(gè)過(guò)程對(duì)于昆蟲(chóng)的成活至關(guān)重要。酚氧化酶抑制劑理論可以為開(kāi)發(fā)以該酶為靶標(biāo)的新型害蟲(chóng)控制劑提供重要的線索。野桑蠶和桑尺蠖是桑園的主要害蟲(chóng)，終年危害桑樹(shù)，常爆發(fā)成災(zāi)。采用化學(xué)方法防治，存在害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)和污染環(huán)

2、境等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)對(duì)環(huán)境友好和專一的酶抑制劑有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究以鱗翅目的害蟲(chóng)野桑蠶和桑尺蠖以及典型的模式生物家蠶為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶的分離純化、生化特性、抑制動(dòng)力學(xué)以及對(duì)野桑蠶酚氧化酶原基因克隆、生物信息學(xué)分析、半定量RT-PCR表達(dá)譜和家蠶酚氧化酶原基因表達(dá)譜差異比較及RNAi等的研究和分析，主要獲得以下結(jié)果： 1.采用0-40％飽和度的硫酸銨鹽析沉淀對(duì)野桑蠶酚氧化酶進(jìn)行了分離純化，結(jié)果酶活力提高

3、了2.33倍，然后用Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析技術(shù)對(duì)野桑蠶酚氧化酶進(jìn)行了純化，經(jīng)兩步純化后，酚氧化酶活力提高了57.14倍。 2.采用0-80％飽和度的硫酸銨鹽析沉淀對(duì)桑尺蠖酚氧化酶進(jìn)行了分離純化，結(jié)果酶活力提高了1.55倍，然后用Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析技術(shù)對(duì)桑尺蠖酚氧化酶進(jìn)行了純化，經(jīng)兩步純化后，酚氧化酶活力提高了6.28倍。 3.野桑蠶酚氧化酶的最適pH值為7.0，在33℃-43℃的范

4、圍內(nèi)，酶活性幾乎無(wú)變化，其最適溫度為37℃左右。70℃時(shí)保溫15min，酶活力還有原活力的28％。 4.桑尺蠖酚氧化酶的最適pH值為7.0，最適溫度為37℃。70℃時(shí)保溫15min，酶活力還有原活力的12％。 5.以3種結(jié)構(gòu)相似的多元酚作為底物研究野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶底物專一性的結(jié)果表明，野桑蠶酚氧化酶對(duì)鄰苯二酚的親和力高于L-多巴，對(duì)焦性沒(méi)食子酸的親和力最低，該酶對(duì)鄰苯二酚、L-多巴和焦性沒(méi)食子酸的Km值分別為2.0

5、6mmol/L、3.17mmol/L和3.39mmol/L。而桑尺蠖酚氧化酶對(duì)L-多巴的親和力高于鄰苯二酚，對(duì)焦性沒(méi)食子酸的親和力最低，該酶對(duì)L-多巴、鄰苯二酚和焦性沒(méi)食子酸的Km值分別為4.30rnmol/L、6.82mmol/L和9.64mmol/L。另外，還分別研究了反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、酶濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系。 6.研究EDTA-2Na和金屬離子對(duì)野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶活力的影響，結(jié)果表明Mg2+、Ca2+和zn2+對(duì)野桑

6、蠶酚氧化酶有較強(qiáng)的激活作用，EDTA-2Na和Cu2+能強(qiáng)烈地抑制該酶的活性。而Mg2+、Ca2+對(duì)桑尺蠖酚氧化酶有較強(qiáng)的激活作用，EDTA-2Na、Zn2+和Cu2+對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用。 7.研究有機(jī)溶劑和多種氧化酶抑制劑對(duì)野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶活力的影響，結(jié)果表明甲醇、乙醇、丙三醇、異丙醇和多種氧化酶抑制劑對(duì)酶活力均有不同程度的抑制作用，且具有濃度依賴性。 8.用槲皮素作抑制劑，研究其對(duì)野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶的抑

7、制動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，槲皮素是野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其抑制常數(shù)(Ki)分別為44.61μmol/L和20.5μmol/L. 9.用硫脲作抑制劑，研究其對(duì)野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶的抑制動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，硫脲是野桑蠶和桑尺蠖酚氧化酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其抑制常數(shù)(Ki)分別為0.070μmol/L和0.18mmol/L。 10.通過(guò)RT-PCR技術(shù)，克隆了野桑蠶酚氧化酶原基因PPO1和PPO2，序列已在GenBan

8、k上登錄，登錄號(hào)分別為EU569724和EU047703，基因的cDNA長(zhǎng)度分別為2086bp和2134 bp。其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為2058 bp和2082 bp，分別編碼685和693個(gè)氨基酸殘基。PPO1和PPO2基因序列均具有與家蠶等其它鱗翅目昆蟲(chóng)PPO基因相似的絲氨酸蛋白酶酶切位點(diǎn)、2個(gè)高度保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)、位于銅離子結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的6個(gè)保守的組氨酸殘基及5個(gè)可能的N連接糖基化位點(diǎn)，無(wú)信號(hào)肽序列。在線工具預(yù)測(cè)野桑蠶PPO1和P

9、PO2基因編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分別為pI/Mw：6.28/78.703KDa和pI/Mw：5.62/80.075KDa。同源序列的多序列比對(duì)結(jié)果顯示野桑蠶和家蠶．PPO1和PPO2基因及其編碼的氨基酸序列同源性很高，野桑蠶和家蠶PPO1基因只有14個(gè)堿基的差異，5個(gè)氨基酸的不同；PPO2基因只有21個(gè)堿基的差異，3個(gè)氨基酸的不同。在家蠶基因組中的BLASTN程序檢索，發(fā)現(xiàn)兩基因在基因組中均只有一個(gè)拷貝，cDNA與基因組序列比對(duì)，發(fā)

10、現(xiàn)PPO1具有13個(gè)外顯子、12個(gè)內(nèi)含子；PPO2具有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子，且外顯子/內(nèi)含子邊界都符合GT-AG規(guī)則。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明野桑蠶和家蠶的親緣關(guān)系最近，與微生物和哺乳動(dòng)物等的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這進(jìn)一步說(shuō)明了家蠶起源于野桑蠶。 11.通過(guò)對(duì)PPO1和PPO2基因在野桑蠶和家蠶中的半定量RT-PCR表達(dá)譜差異比較分析表明PPO1和PPO2基因在野桑蠶和家蠶的不同組織及不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)是有差異的，且基因表達(dá)的差異較大。這