甜橙多胺氧化酶基因克隆及功能鑒定.pdf

1、柑橘是世界上最重要的果樹之一，然而各種生物脅迫和非生物脅迫嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和質(zhì)量。多胺是普遍存在于高等植物中的一類低分子量脂肪族陽(yáng)離子聚合物，其分解代謝在調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答中多胺動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用。多胺分解代謝主要由銅胺氧化酶(CuAO)和多胺氧化酶(PAO)催化完成。本研究利用甜橙基因組數(shù)據(jù)挖掘甜橙CuAO和PAO家族成員，分析其表達(dá)模式，最后利用遺傳轉(zhuǎn)化及生物化學(xué)技術(shù)揭示了部分成員的功能。主要結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)搜索比對(duì)共得

2、到8個(gè)甜橙CuAO候選基因（命名為CsCuAO1-CsCuAO8），分別位于3條染色體上，編碼區(qū)大小分別從1389 bp到2328bp。等電點(diǎn)和相對(duì)分子量預(yù)測(cè)結(jié)果顯示甜橙CuAO蛋白等電點(diǎn)范圍為6.11-8.77，相對(duì)分子量為52.1-82.8 kDa。親緣關(guān)系分析顯示CsCuAO基因家族成員可以分為兩類。CsCuAO擁有植物CuAO高度保守的33個(gè)氨基酸殘基，并且含有C端或者N端信號(hào)肽序列。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CsC uA O1-3和Cs

3、CuAO5在根、莖、葉和子葉中表達(dá)量較高，其它基因表達(dá)水平較低。外源腐胺(Put)，亞精胺(Spd)和精胺(Spm)誘導(dǎo)CsCuAO基因表達(dá)上升。此外，ABA、低溫、鹽害及滲透脅迫抑制CsCuAO基因（CsCuAO1-2，CsCuAO5，CsCuAO6和CsCuA O8）表達(dá)但誘導(dǎo)CsCuAO3和CsCuAO7上調(diào)表達(dá)。
　　2.比對(duì)分析共發(fā)現(xiàn)6個(gè)甜橙PAO候選基因CsPAO1-CsPA O6。根據(jù)親緣關(guān)系可將CsPAO基因分為四

4、類。CsPAO基因在根中表達(dá)水平高于莖、葉和子葉中的水平。CsPAO基因表達(dá)也受到外源多胺處理的誘導(dǎo)，根據(jù)其表達(dá)模式推測(cè)CsPAO4基因可能參與多胺末端分解代謝而其余CsPAO基因可能參與多胺回復(fù)反應(yīng)代謝。同時(shí)在煙草中超表達(dá)CsPAO3基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)Put含量，并且降低Spd和Spm含量，說(shuō)明該基因確實(shí)參與多胺回復(fù)反應(yīng)代謝。另外，CsPAO基因同時(shí)受到ABA、低溫、鹽害和滲透脅迫的誘導(dǎo)，說(shuō)明其可能參與激素和逆境脅迫應(yīng)答。

5、分析CsPAO基因啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)共有203個(gè)與激素和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。
　　3.為闡明PAO基因功能，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化和生物化學(xué)技術(shù)分析了CsPAO4在多胺分解代謝和逆境應(yīng)答中的功能。CsPAO4基因位于質(zhì)外體中。體外底物催化結(jié)合HPLC檢測(cè)，表明CsPAO4可以催化Spd和Spm并生成二氨基丙烷（Dap），說(shuō)明該蛋白能夠參與多胺末端分解代謝。在煙草中超表達(dá)CsPAO4基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)AO酶活性顯著高于野生型，而Spd