高效液相色譜在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

1、高效液相色譜在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用高效液相色譜在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用蛋白質(zhì)是一種長鏈高分子化合物，相對分子量大，在溶液中擴(kuò)散系數(shù)大，易變性，者增加了普通方式分離蛋白質(zhì)的困難。高效液相色譜在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備高速、高效、高靈敏度的特點。已被廣泛應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在物理、化學(xué)及功能上的差異為蛋白質(zhì)的分離檢測提供了基礎(chǔ)。根據(jù)蛋白質(zhì)的大小、電荷、疏水性等特性，可以選擇不同模式來分離目標(biāo)蛋白。反向高效液相色

2、譜在高效液相色譜中應(yīng)用廣泛。由于反相高效液相色譜固相載體的疏水性，它可以根據(jù)流動相中被分離物質(zhì)分子疏水性的不同而發(fā)生強弱不同的相互作用，從而使不同分子在反相柱中彼此分離。疏水性弱的樣品，分子和固定相間的作用弱，因而較快流出。在反相液相色譜中，蛋白質(zhì)分子在通過色譜柱時會發(fā)生或多或少的去折疊，使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部某些疏水殘基暴露，并與固定相相互作用。這是反相液相色譜在蛋白質(zhì)分離中的一個有力因素。同時蛋白質(zhì)有一個特殊的保留機(jī)制，這是由吸附機(jī)制與

3、分配機(jī)制共同作用的結(jié)果。在蛋白質(zhì)的分離中，初始洗脫條件下洗脫液中有機(jī)成分的濃度較低，分子與固定相疏水作用強，幾乎完全被固定相吸附；而一旦洗脫液中有機(jī)成分達(dá)到特定濃度，使得蛋白質(zhì)與固定相的作用小于它與流動相間的相互作用時，分子完全從固定相上洗脫。正是由于蛋白質(zhì)的這種特殊的保留機(jī)制，洗脫液成分極微小的改變就會大大影響蛋白質(zhì)的保留行為從而保證蛋白質(zhì)得以完全分離。蛋白質(zhì)通常是強極性的化合物，與碳十八色譜柱結(jié)合較困難。另外，反相液相色譜常用的流動

4、相，如甲醇、乙腈等都能使蛋白質(zhì)變性沉積而使色譜柱報廢。因此，在反相液相色譜用于蛋白質(zhì)分離時，一般使用低pH流動相，室溫或較高溫度以及使用乙腈或異丙醇作為有機(jī)部分，三氟乙酸作為流動相添加劑。離子交換色譜是最早被用于蛋白質(zhì)分離的一種方法。離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。因為離子交換色譜要求分離樣品具有帶電性質(zhì)的差異。而蛋白質(zhì)等電點的差異，以及在不同pH值溶液中帶電性質(zhì)會發(fā)生變

5、化的特性，使得用離子交換色譜分離蛋白質(zhì)成為可能。離子交換色譜又可分為陰離子和陽離子交換色譜。大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH值為6到8時，帶負(fù)電荷，因此用陰離子交換色譜來分離，如人乳或牛乳中的骨橋蛋白。對于一些等電點較高的蛋白質(zhì)，如乳鐵蛋白，則采用陽離子交換色譜更為有效。在選擇離子交換劑時，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機(jī)離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強，適合于分離蛋白質(zhì)

6、等大分子物質(zhì)。其中離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。

7、三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為蛋白質(zhì)分離中非常重要的一類離子交換劑。生物素和親和素生物素和親和素生物素(biotion)和親和素(avidin)之間具有很強而特異的親和力可以用于親和層析。如用親和素分離含有生物素的蛋白等。生物素和親和素的親和力很強其解離常數(shù)為1015M酰氨基葡萄糖或N乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合可以用于血型糖蛋白A、紅細(xì)胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時只需用相應(yīng)的單糖或類似物就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來。如洗脫伴刀豆球

8、蛋白A吸附的蛋白可以用aD吡喃甘露糖苷或a凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細(xì)胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。6.輔酶輔酶核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子利用它們與對應(yīng)酶的親和力可以對多種酶類進(jìn)行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD、

9、NADP等等應(yīng)用很廣泛可以用于分離各種激酶和脫氫酶。7.多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸利用polyU作為配體可以用于分離mRNA以及各種polyU結(jié)合蛋白。polyA可以用于分離各種RNA、RNA聚合酶以及其它polyA結(jié)合蛋白。以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。8.氨基酸氨基酸固定化氨基酸是多用途的介質(zhì)通過氨基酸與其互補蛋白間的親和力或者通過氨基酸的疏水性等性質(zhì)可以用于多種