核酸非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、試劑等試劑等電泳儀、電泳槽、電泳玻璃板（數(shù)套）、鯊魚齒（67空，數(shù)條）、邊條（數(shù)對）、加樣槍（1ml、5ml、10μl、100μl、200μl）、脫色搖床、合適大小的托盤數(shù)個95%乙醇、冰醋酸、紗布、醫(yī)用膠布、剝離硅烷和親和硅烷（鼎國）、10%APS（過硫酸銨）（液體狀試劑一周內(nèi)有效）、TEMED、40%丙烯酰胺（19:1，上海生工）、尿素（進口，amresco），未注明的均為國產(chǎn)分析純試劑試劑配制試劑配制親和硅烷：加10μlBindS

2、ilane（親和硅烷）于1ml含10μl醋酸的95%乙醇中，混勻后備用。（涂玻璃板用）固定脫色液：10%乙醇，蒸餾水配置（可重復用）硝化液：15ml硝酸L蒸餾水染色液：1gAgNO3L蒸餾水顯色液：30gNa2CO3L蒸餾水（溫度不可高，否則顯色背景深；可預冷，預冷后可延長顯色時間，有助于減輕顯色背景，一般情況時室溫即可，顯色約需3～5min）終止顯色液：10%冰醋酸電泳用的TAE用蒸餾水配制，制膠用的所有試劑均用雙蒸水配制。非變性聚丙

3、烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠及電泳制膠及電泳（1）膠板的準備：首先確定兩塊玻璃板是否平整，用去污劑和清水將玻璃板洗滌干凈，并用蒸餾水沖洗，晾干后用95%乙醇擦拭。1用1～2ml95%的乙醇依次將長玻璃和短玻璃的正面擦拭干凈、均勻；（以平整、光滑的一面為正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）2用加樣槍取1ml配置好的親和硅烷均勻分布于長玻璃的正面，用紗布涂抹均勻；（第一次用的玻璃板最好用親和硅烷擦2～3次）5~7μl的擴增

4、產(chǎn)物。（6）電泳：140160w恒功率電泳，待溴酚藍至膠的四分之三處時（大約需要1.5~2h），終止電泳，回收電泳液（可重復用一段時間，當發(fā)現(xiàn)電壓下降很多時要更換電泳液，或者補加蒸餾水可繼續(xù)用一段時間），取下膠板，將兩塊玻璃板輕輕分開，凝膠留在長玻璃板上。銀染銀染（1）固定（脫色）：在托盤1中加入1L固定脫色液，將有膠的玻璃板膠面向上放入托盤中，置于脫色搖床上低速搖6～10min。（2）洗膠：在托盤2中用1L蒸餾水漂洗凝膠約10s。（3

5、）硝化：在托盤3中用1L硝化液硝化凝膠5min。（4）洗膠：繼續(xù)在托盤2中漂洗凝膠10s。（5）染色：在托盤4內(nèi)加入1L染色液，將膠板放入托盤中低速搖15min。（6）顯影：從染色液中取出膠板，立即將膠板置于顯色液中低速搖至顯色，直至膠上所有的條帶都出現(xiàn)。（7）定影（終止顯色）：從顯影液中取出膠板放入終止液中約1min以終止顯色。（8）洗膠：將膠板置于自來水下沖洗正反面直至干凈。（9）干膠：室溫下自然干燥，記錄實驗結(jié)果，并用掃描儀或相機