新月彎孢霉漆酶高產(chǎn)菌株選育及漆酶純化研究.pdf

1、為提高新月彎孢霉分泌漆酶的產(chǎn)量和活性,本文利用物理誘變法(紫外-60Co-γ復(fù)合誘變,微波誘變)和化學(xué)誘變法(硫酸二乙酯誘變)對(duì)新月彎孢霉菌株進(jìn)行誘變。在紫外-60Co-γ的作用下,新月彎孢霉分泌漆酶的活性由原始的0.55U/ml提高到1.668U/ml。存微波作用下,新月彎孢霉分泌漆酶活性由1.668 U/ml提高到1.914 U/ml。在硫酸二乙酯作用下,新月彎孢霉分泌漆酶活性由1.914 U/ml提高到1.949 U/ml。最終酶

2、活比原始酶活提高了近3.544倍。新月彎孢霉菌株致死率和正突變率變化有一定相關(guān)性,致死率在80％到90％時(shí),正突變率最高。
　　 通過以上誘變,得到高產(chǎn)漆酶菌株VC-W-L3,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了新月彎孢霉VC-W-L3產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件,培養(yǎng)基成分。通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)得到新月彎孢霉產(chǎn)漆酶的最適工藝條件為:發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間72 h,培養(yǎng)基pH6,250 ml三角瓶裝液量120 ml,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。最佳

3、培養(yǎng)基配比為:土豆200 g/L,蔗糖30g/L,大豆蛋白胨5 g/L,KH2PO45 g/L,愈創(chuàng)木酚0.2 mmol/L,吐溫800.1 ml/L,Mg2+0.5 mmol/L,Cu2+1 mmol/L,Ca2+1 mmol/L,Mn2+0.25 mmol/L。其最高酶產(chǎn)量為2.306U/ml,比培養(yǎng)基優(yōu)化前的提高了18.32％。利用工業(yè)廢料作為培養(yǎng)基主要成分,通過單因素,正交試驗(yàn)得出最佳配比:廢糖蜜30 ml/L,豆粕15 g/L

4、,KH2PO45g/L,愈創(chuàng)木酚0.2 mmol/L,吐溫800.1 ml/L,Mg2+0.5 mmol/L,Cu2+1 mmol/L,Ca2+1 mmol/L,Mn2+0.25mmol/L。最佳產(chǎn)酶量為1.485U/ml。
　　 通過對(duì)新月彎孢霉發(fā)酵液采用硫酸銨鹽析,透析,PEG6000濃縮,DEAE-SepharoseFF離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾等純化技術(shù)進(jìn)行處理,純化得到新月彎孢霉胞外的漆酶,最終純化

5、倍數(shù)為3.73,總活力回收率為31.69％,由SDS-PAGE電泳圖片計(jì)算得出純酶的分子量為86.3 kDa。
　　 以ABTS作為底物時(shí)新月彎孢霉純化后的漆酶的最適反應(yīng)pH為3.0,在pH2.8～3.5之間,漆酶活性較高;在pH為5.5～6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定性最好,1h內(nèi)平均剩余酶活在87％以上。新月彎孢霉純化后的漆酶的最適反溫度為30℃,在20～30℃之間,漆酶熱穩(wěn)定較好。純化后的漆酶催化ABTS的米氏常數(shù)為0.064_mmo