大斑剛毛座腔菌漆酶基因功能驗證及高產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、漆酶作為一種多酚氧化酶，不僅在真菌的生活史中發(fā)揮著重要作用，同時在工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用價值。本研究為了分析漆酶在玉米大斑剛毛座腔菌中的功能，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了該病菌漆酶家族多個基因在發(fā)育階段和誘導(dǎo)條件下的表達(dá)規(guī)律;繼而利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得了其中較為重要的StLAC1和StLAC2基因回復(fù)突變體，并分析了它們在在生長發(fā)育及侵染中的功能;此外利用響應(yīng)面法優(yōu)化大斑剛毛座腔菌產(chǎn)漆酶的發(fā)酵工藝，研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)

2、。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了大斑剛毛座腔菌漆酶多基因家族中的多個基因表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示不同漆酶基因在病菌不同發(fā)育時期及不同誘導(dǎo)物下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量具有差異性，其中StLAC1主要在附著胞和侵入釘時期表達(dá)，說明其主要參與了侵染過程;StLAC2只有在分生孢子時期表達(dá)量明顯高于其他漆酶基因，說明StLAC2主要在分生孢子發(fā)育時2發(fā)揮作用;StLAC6、StLAC8除在分生孢子時期之外的其他時期表達(dá)水平均較

3、高;StLAC2、StLAC4、StLAC5在植保素白藜蘆醇的誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯增加;StLAC6、StLAC8在ABTS及銅離子誘導(dǎo)下表達(dá)量增加。以上結(jié)果說明，漆酶家族各基因在侵染過程的不同時期及不同培養(yǎng)條件下分別發(fā)揮作用。
　　2.利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了突變菌株△StLAC1、△StLAC2基因的功能回復(fù)突變體C.△StLAC1、C.△StLAC2。
　　3.對大斑剛毛座腔菌野生型菌株01-23、

4、敲除突變體△StLAC1、回復(fù)突變體C.△StLAC1進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，相比于基因缺失突變體△StLAC1，回復(fù)突變體C.△StLAC1生長速率變快，黑色素合成增加，滲透調(diào)節(jié)能力減弱，附著胞膨壓、侵染能力顯著回復(fù)，漆酶活性增強(qiáng)，離體葉片致病性變強(qiáng)。說明StLAC1基因在大斑剛毛座腔菌黑色素合成、附著胞穿透力和致病性等方面具有重要作用。
　　4.對大斑剛毛座腔菌野生型菌株01-23、敲除突變體△StLAC2、回復(fù)突變體C.△StLA

5、C2進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，回復(fù)突變體C.△StLA C2氣生菌絲茂盛，菌絲細(xì)胞壁變厚，疏水能力變強(qiáng)，耐鹽性降低，細(xì)胞壁完整性回復(fù);漆酶活性有所升高，黑色素合成能力回復(fù)，侵染能力顯著上升。說明StLAC2基因影響了大斑剛毛座腔菌黑色素合成、附著胞穿透力和生長發(fā)育等諸多方面。
　　5.以質(zhì)粒pBS為骨架，以草銨膦的基因為抗性基因，成功構(gòu)建了StLAC2基因的敲除載體，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法獲得StLAC1、StLAC2雙基因缺失突變體△StL

6、AC2/△StLAC2。
　　6.建立了以漆酶酶活力為響應(yīng)值的多元二次回歸模型，多元二次回歸模型差異顯著(p=0.0001)，可以用該模型來擬合試驗;響應(yīng)面分析結(jié)果表明，各因素對漆酶活性的影響大小依次為Cu2+＞葡萄糖＞尿素，而葡萄糖和尿素交互作用極顯著;通過擬合求出模型極值點(diǎn)，對應(yīng)的大斑剛毛座腔菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)條件為:葡萄糖50.05g/L，KH2PO41g/L，尿素1.46 g/L，MgSO40.5 g/L，蛋白胨2g/L，