黃酮類化合物的檢識(shí)與結(jié)構(gòu)鑒定

1、第四節(jié)　黃酮類化合物的檢識(shí)與結(jié)構(gòu)鑒定,目前主要采用的方法有：①與標(biāo)準(zhǔn)品或與文獻(xiàn)對(duì)照PPC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf?100）?、诜治鰧?duì)比樣品在甲醇溶液中及加入診斷試劑后得到的UV光譜③1H -NMR ④13C -NMR ⑤MS,一、色譜在黃酮類鑒定中的應(yīng)用,1. 紙層析(PPC)苷類成分可采用雙向展開(kāi)，第一相展開(kāi)采用醇性溶劑，如BAW系統(tǒng)（正丁醇： 醋酸：水4：1：5上層）；第二相展開(kāi)用水性溶劑，如氯仿：醋酸：水

2、（3：6：1） 苷元?jiǎng)t多采用醇性溶劑。 花色苷及其苷元，可用含鹽酸或醋酸的溶劑。顯色劑：2%三氯化鋁甲醇液（紫外光下檢測(cè)）； 1%FeCl3 / 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。,2. 薄層層析(TLC),１）硅膠薄層 用于弱極性黃酮較好。 常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲醇（95：5）或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等。,２）聚酰胺層析適用范圍廣，可分離含游離酚羥基或其苷類。

3、常用展開(kāi)系統(tǒng)：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。,二、紫外光譜在黃酮類鑒定中的應(yīng)用,可用于確定黃酮母核類型及確定某些位置是否含有羥基。一般程序： ①測(cè)定樣品在甲醇中的UV譜以了解母核類型； ②在甲醇溶液中分別加入各種診斷試劑后測(cè)UV譜和可見(jiàn)光譜以了解3,5,7,3’,4’有無(wú)羥基及鄰二酚羥基； ③苷類可水解后（或先甲基化再水解），再用上法測(cè)苷元的UV譜以了解糖的連接位置。,（一）黃酮類化合物在甲醇溶液中的紫

4、外光譜,多數(shù)黃酮類化合物由兩個(gè)主要吸收帶組成： 帶I在300-400nm區(qū)間，由B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)的電子躍遷所引起。,B,B,帶II在240-285nm區(qū)間，由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)的電子躍遷所引起。,A,A,不同類型黃酮類化合物的紫外光譜,2．加入診斷試劑后引起的位移及結(jié)構(gòu)測(cè)定,說(shuō)明：,（1）+NaOMe或NaOAc, OH?ONa，變?yōu)殡x子化合物，共軛系統(tǒng)中的電子云密度增加，紅移 另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH時(shí)，在NaO

5、Me作用下易氧化破壞，故峰有衰減。（2）NaOAc為弱堿，僅使酸性較強(qiáng)者，如7,4’-OH解離。,（3）,形成絡(luò)合物的能力：黃酮醇3-OH >黃酮5-OH（二氫黃酮5-OH）> 鄰二酚羥基 > 二氫黃酮醇5-OH鄰二酚羥基和二氫黃酮醇5-OH在酸性條件下不與AlCl3絡(luò)合；但不在酸性條件下，五者皆與Al3+絡(luò)合；形成絡(luò)合物越穩(wěn)定，紅移越多。,（4） 根據(jù)只加AlCl3和加入AlCl3及鹽酸的紫外光譜吸收峰位相

6、減的結(jié)果，可以判斷鄰二酚羥基的取代情況。,山柰苷 山柰酚UVλmax(nm) 帶II 帶I 帶II 帶IMeOH 265 345 267 367NaOMe 265 388 278 416（分解）AlCl3 275 399

7、 268 424AlCl3/HCl 275 399 269 424NaOAc 265 399 276 387NaOAc/H3BO3 265 345 267 367,從中藥柴胡中分離得到山柰苷，經(jīng)酸水解后，用PC檢出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光譜數(shù)據(jù)如下：,山柰酚3，7-二鼠

8、李糖苷,三、1H-NMR,常用溶劑：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲基亞砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可將黃酮類化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中進(jìn)行測(cè)定。,黃酮類化合物1H-NMR譜(DMSO-d6)羥基的特征,δ5－OH：≈12 ppmδ7－OH：≈11 ppmδ3－OH：≈10 ppm,氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）對(duì)鑒別黃酮母核上的酚羥基，是十分理想的溶劑，在試樣中加入重水（ D2O）羥基質(zhì)子信號(hào)

9、消失。,（一）A環(huán)質(zhì)子,1．5, 7-二-OH黃酮,黃酮類1H-NMR（三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中測(cè)定）,當(dāng)7-OH成苷時(shí)，則H-6及H-8信號(hào)均向低場(chǎng)方向位移。,2．7-OH黃酮,H-5較H-6、H-8低場(chǎng)，是由于羰基的負(fù)屏蔽效應(yīng)的影響。H-6、H-8較5, 7-二OH黃酮在較低場(chǎng)，且相互位置可能顛倒。,（二）   B環(huán)質(zhì)子 δ6.5-8,1．4’-氧取代黃酮類化合物,H-3’, 5’ ? 6.5-7.1

10、, d, J=8.5HzH-2’, 6’ ? 7.1-8.1, d, J=8.5Hz由于C環(huán)對(duì)H-2’, 6’的負(fù)屏蔽作用大于對(duì)H-3’, 5’， 且H-3’, 5’受4’-OR的屏蔽作用，故前者較低場(chǎng)；C環(huán)氧化程度越高，H-2’, 6’處于越低場(chǎng)的位置。,2．3’, 4’-二氧取代黃酮類化合物,H-2’受C環(huán)負(fù)屏蔽和3’-OR屏蔽作用，H-6’ 也受C環(huán)負(fù)屏蔽作用，而H-5’則僅4’-OR屏蔽作用。故由低場(chǎng)到高場(chǎng)的順序?yàn)椋?/p>

11、H-6’? H-2’ ?H-5’。但有時(shí)也會(huì)發(fā)生H-2’和H-6’重疊的現(xiàn)象。,（1）3’, 4’-二氧取代黃酮及 黃酮醇H-5’ ? 6.7-7.1 d, J=8.5HzH-2’ ? 7.2 d, J=2.5HzH-6’ ? 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz,（2）3’, 4’-二氧取代異黃酮、二氫黃酮及 二氫黃酮醇 H-2’, 5’,6’常作為一個(gè)復(fù)雜多重峰（通常為兩組

12、峰）? 6.7-7.1,3．3’, 4’,5’-三氧取代黃酮類化合物,若R1=R2=R3=H，則H-2’,6’為單峰，? 6.7-7.5若上述條件不成立（如3’或5’甲基化或苷化時(shí)），則H-2’,6’分別為二重峰（J=2Hz）,（三）   C環(huán)質(zhì)子,1. 黃酮類,2. 異黃酮類,H-2位于羰基?位，同時(shí)受羰基和苯環(huán)的負(fù)屏蔽作用，且通過(guò)碳與氧相連，故較一般芳香質(zhì)子低場(chǎng)，δ7.6-7.8。若用DMSO-d6作溶劑，則

13、δ8.5-8.7。,3. 二氫黃酮和二氫黃酮醇,1) 二氫黃酮,兩個(gè)H-3, 分別為dd峰，中心位于δ2.8 ，J = 17Hz（偕偶），5Hz（順偶）及J = 17Hz（偕偶），11Hz（反偶）,H-2, dd, δ5.2, Jtrans = 11Hz（反偶）, Jcis = 5Hz（順偶）,（2）二氫黃酮醇,3-OH苷化，供電子能力下降，兩個(gè)氫的δ值升高（向低場(chǎng)位移），可用于判斷二氫黃酮醇苷中糖的位置。,H-2與H-3為反

14、 式雙直立鍵， J=11HzH-2 δ 4.9H-3 δ 4.3,H- α ： δ 6.50-6.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 )H- β ： δ 7.30-7.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 ),查耳酮：,芐氫:δ6.50-6.70( 1H,s ) δ6.37-6.94( 1H,s, DMSO-d6 ),橙酮：,（四）  糖上的質(zhì)子,1. 單糖苷類 糖

15、與苷元相連時(shí)，糖上1?-H與其它 H比較，一般位于較低磁場(chǎng)區(qū)。因-OR (R=苷元) 不表現(xiàn)供電子，僅表現(xiàn)吸電子的誘導(dǎo)作用，端基H受兩個(gè)O的誘導(dǎo)，處于低場(chǎng)（?4.0-6.0）,1）葡萄糖位于不同位置時(shí)端基H化學(xué) 位移的區(qū)別： C3-OR 1?-H的? 值約為5.8 C-5, C-6, C-7, C-4’-OR 1?-H的? 值約為4.8-5.2,2) 葡萄糖苷與鼠

16、李糖苷的區(qū)別 黃酮醇3-O-葡萄糖苷?5.8, d, J=7Hz （二直立鍵偶合系統(tǒng)） 黃酮醇3-O-鼠李糖苷?5.0-5.1, d, J=2Hz （二平伏鍵偶合系統(tǒng)） 另外鼠李糖上的C-CH3 ?0.8-1.2, d, J=6.5Hz,化合物 糖上的H-1’’黃酮醇3-O-葡萄糖苷5.70-6.00黃酮醇7-O-葡萄糖苷 4.80-5.20黃酮醇4&

17、#39;-O-葡萄糖苷 黃酮醇5-O-葡萄糖苷 黃酮醇6及8-C-糖苷黃酮醇3-O-鼠李糖苷 5.00-5.10二氫黃酮醇3-O-葡萄糖苷 4.10-4.30二氫黃酮醇3-O-鼠李糖苷 4.00-4.20,,糖上的氫,2. 雙糖苷類末端糖上的H-1’’’因離黃酮

18、母核較遠(yuǎn)，受到的負(fù)屏蔽作用較小，因而較H-1’’處于較高場(chǎng)的位置。,取代基 δ 甲基 2.04-2.45 ( 3H,s ) 乙酰氧基 2.30-2.45 ( 3H, s ) 甲氧基 3.45-4.10 ( 3H, s ),苯環(huán)上其他取代基的氫：,四、13C-NMR,方法： （1

19、）對(duì)比法：與簡(jiǎn)單的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它們的衍生物光譜的比較； （2）計(jì)算法：用經(jīng)驗(yàn)的簡(jiǎn)單芳香化合物的取代位移加和規(guī)律進(jìn)行計(jì)算； （3）選用各種一維和二維NMR技術(shù)。,（一）骨架類型的判斷,根據(jù)中央三碳鏈的碳信號(hào)，即先根據(jù)羰基碳的δ值，再結(jié)合C2、C3在偏共振去偶譜中的裂分和δ值判斷。,（二）黃酮類化合物取代圖式的確定方法,黃酮類化合物中芳香碳原子的信號(hào)特征可以用來(lái)確定取代基的取代圖式。以黃酮為例，其13C-NMR

20、信號(hào)如下所示：,1．取代基位移的影響,-OH及-OCH3的引人將使直接相連碳原子(α-碳)信號(hào)大幅度地向低場(chǎng)位移，鄰位碳原子(β-碳)及對(duì)位碳則向高場(chǎng)位移。間位碳雖也向低場(chǎng)位移，但幅度很小。,A-環(huán)上引入取代基時(shí)，位移效應(yīng)只影響到A環(huán)，而B(niǎo)-環(huán)上引入取代基時(shí)，位移效應(yīng)只影響到B環(huán)。若是一個(gè)環(huán)上同時(shí)引入幾個(gè)取代基時(shí)，其位移效應(yīng)將具有某種程度的加和性。,黃酮母核上引入5-OH時(shí)，不僅影響A環(huán)碳原子的化學(xué)位移，還因C5-OH與C4=O形成分子

21、內(nèi)氫鍵締合，故可使C4，C2信號(hào)向低場(chǎng)移動(dòng)(分別為+4.5及+0.9)，而C-3信號(hào)向高場(chǎng)移動(dòng)(–2.0)。C5-OH如果被甲基化或苷化(氫鍵締合遭到破壞)，則上述信號(hào)將分別向高場(chǎng)位移。,2．5，7-二羥基黃酮類中C-6及C-8信號(hào)的特征,對(duì)大多數(shù)5，7—二羥基黃酮類化合物來(lái)說(shuō)，C-6(d)及C-8(d)信號(hào)在δ90．0～100．0的范圍內(nèi)出現(xiàn)，且C-6信號(hào)總是比C-8信號(hào)出現(xiàn)在較低的磁場(chǎng)。在二氫黃酮中兩者差別較小，約差0．9個(gè)化學(xué)位

22、移單位，但在黃酮及黃酮醇中差別較大，約為4.8。C-6或C8有無(wú)烷基或者芳香基取代可通過(guò)觀察13C-NMR上C-6，C-8信號(hào)是否發(fā)生位移而加以認(rèn)定。,生松素(pinocembrin)及其6-C-甲基及8-C-甲基衍生物的C-6，C-8,木犀草素(1uteolin)，即使因其C6上聯(lián)接的H被-OH取代而向低場(chǎng)大幅度的位移，C-8信號(hào)也未因此而發(fā)生大的改變。,(三)黃酮類化合物O-糖苷中糖的連接位置,1．糖的苷化位移及端基碳的信號(hào)

23、酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移約為+4.0～+6.0。黃酮苷類化合物當(dāng)苷化位置在苷元的7或2’、3’、4’時(shí)，糖的C-1信號(hào)將位于約δ100.0～102.5范圍內(nèi)。5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相應(yīng)的C-1信號(hào)分別出現(xiàn)δ104.3及99.0處.。,黃酮類雙糖苷或低聚糖苷的13C-NMR中，糖的端基碳信號(hào)出現(xiàn)在δ98.0～109.0區(qū)域內(nèi)，常與C-6，C-8，C-3及C-10混在一起而不易區(qū)別。可采用HMQC (1H-detect

24、ed heteronuclear multiple-quantum coherence)等二維核磁共振技術(shù)鑒別。,2．苷元的苷化位移,苷元苷化后與糖直接相連碳原子向高場(chǎng)位移，其鄰位及對(duì)位碳原子則向低場(chǎng)位移，且對(duì)位碳原子的位移幅度大而且恒定。C-5-OH糖苷化后，除上述苷化位移效應(yīng)外，還因C5-OH與C4＝O的氫鍵締合受到破壞，故對(duì)C環(huán)碳原子也將發(fā)生巨大的影響。C2，C-4信號(hào)明顯地向高場(chǎng)位移，而C-3信號(hào)則移向低場(chǎng)。,(四)雙糖苷及低

25、聚糖苷中分子內(nèi)苷鍵 及糖的聯(lián)接順序,（1）當(dāng)糖上的羥基被苷化時(shí)將使該-OH所在碳原子產(chǎn)生一個(gè)相當(dāng)大的向低場(chǎng)位移。例如在黃酮類化合物蘆丁[苷元-O-β-D-glucosyl-(6→1)-α-L-rhamnoside)中，葡萄糖的C6信號(hào)將向低場(chǎng)位移5.8，但C-5則向高場(chǎng)位移約1.4。,（2）黃酮類雙糖苷及低聚糖苷中糖的聯(lián)結(jié)順序常采用HMBC(1H-detected heteronucler multiple-bond-cohere

26、nce)二維核磁共振技術(shù)進(jìn)行確定。,五、質(zhì)譜在黃酮類結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用,多數(shù)黃酮類化合物苷元在電子轟擊質(zhì)譜(El-MS)中因分子離子峰較強(qiáng)，往往成為基峰，故一般無(wú)須作成衍生物即可進(jìn)行測(cè)定。,但是當(dāng)測(cè)定極性強(qiáng)、難氣化以及對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮苷類化合物時(shí)，則采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等軟電離質(zhì)譜技術(shù)獲得強(qiáng)的分子離子峰[M]+及具有偶數(shù)電子的準(zhǔn)分子離子峰(quasi-molecularion peak) [M+H] +。,(一)黃酮

27、類化合物苷元的電子轟擊質(zhì)譜 (El-MS),黃酮類化合物苷元的El-MS中，除分子離子峰[M]+外，也常常生成[M-1]+即(M-H)基峰。如為甲基化衍生物，則可以得到[M-15]+即(M-CH3)離子。,黃酮類化合物主要有下列兩種基本裂解途徑：,途徑-I（RDA裂解）： 120

28、 102,途徑-II,此外，還有分子離子M+.生成[M-1]+，(M-H)及[M-28]+.(M-CO)；由A1生成[A1-28]+.，(A1-CO)及B2生成[B2-28]+，(B2-CO)等碎片離子。,1．黃酮類裂解基本規(guī)律：,A-環(huán)的取代圖式可通過(guò)測(cè)定A1+.的m/z的值進(jìn)行確定 。同樣，根據(jù)B-環(huán)碎片離子的m/z值，也可精確測(cè)定B環(huán)的取代情況。,一些黃酮類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù),黃酮在有四個(gè)

29、以上氧取代基時(shí)，常常給出中等強(qiáng)度的A1及B1碎片，它具有重要的鑒定意義；但是黃酮醇則不然，當(dāng)氧取代超過(guò)四個(gè)以上時(shí)，只能產(chǎn)生微弱的Al+.及Bl+.碎片離子。,在3，6及8-位含有C-異戊烯基的黃酮類，除一般黃酮裂解途徑外，還產(chǎn)生一些新的碎片離子。如：化合物(I)中A環(huán)上的?，?-二甲烯丙基在裂解過(guò)程中脫去C4H7·碎片，并重排成穩(wěn)定的卓甕離子(Ⅱ) 。,在6-及8-位含有甲氧基的黃酮可失去CH3·，得到[M—15]+

30、強(qiáng)峰(常為基峰)，隨后又失去CO，生成[M-43]離子：,2．黃酮醇類質(zhì)譜,多數(shù)黃酮醇苷元，分子離子峰是基峰，在裂解時(shí)主要按途徑-Ⅱ進(jìn)行，得到B2+離子，繼續(xù)失去CO形成的[B2-28]+.離子。與途徑Ⅱ相比，途徑I通常不太主要。其中，[A+H]+是來(lái)自A-環(huán)的主要離子，其上轉(zhuǎn)移的H來(lái)自3-OR基團(tuán)。,在黃酮醇全甲基化衍生物的質(zhì)譜圖上，B2+離子應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)在m/z105(B環(huán)無(wú)羥基取代)，或135(-OCH3，示B環(huán)有一個(gè)羥基)，或165

31、(有兩個(gè)-OCH3，示B環(huán)有兩個(gè)羥基)或195(有三個(gè)-OCH3，示B環(huán)有三個(gè)羥基)等處，其中最強(qiáng)的峰即為B2+離子。,具有2'-OH或2'-OCH3的黃酮醇類在裂解時(shí)有個(gè)重要特點(diǎn)，即可以通過(guò)失去OH·或 OCH3·，形成一個(gè)新的穩(wěn)定的五元雜環(huán)。,(二)黃酮苷類化合物的FD-MS,黃酮苷類化合物在EI-MS上既不顯示分子離子峰，也不顯示糖基的碎片，故不宜用 EI-MS測(cè)定。 而FD-MS譜

32、可給出強(qiáng)烈的M+及[M+H]+。還給出葡萄糖基的某些碎片，為化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了重要的信息。,在FD-MS中，因?yàn)?M+23Na)離子的強(qiáng)度隨著溶劑極性及發(fā)射絲電流強(qiáng)度的改變而變化，可用以幫助區(qū)別分子離子峰(M)+及偽分子離子峰[M+1]+。,小結(jié)： 第一節(jié) 概述包括（黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)分類、生物活性） 掌握黃酮類化合物的的定義、基本結(jié)構(gòu)、分類和代表化合物。第二節(jié) 理化性質(zhì)和顯色反應(yīng)掌握黃酮類化合物的顏色、旋光性、溶解

33、度的特性及與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，掌握黃酮類化合物的酸堿性，酸性強(qiáng)弱與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系及在提取分離中的應(yīng)用，掌握顯色反應(yīng)與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系及應(yīng)用。,第三節(jié) 提取分離掌握黃酮類化合物的一般提取方法、PH梯度分離法與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，掌握黃酮類化合物聚酰胺柱層析法、硅膠柱層析法和凝膠過(guò)濾法的原理以及它們與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,第四節(jié) 結(jié)構(gòu)鑒定 掌握黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、查耳酮和橙酮的母核紫外光譜特征，掌握加入各種診斷試劑的黃酮類化合