westernblot原理操作及注意事項(xiàng)

1、WesternWesternblotblot的原理、操作及注意事項(xiàng)的原理、操作及注意事項(xiàng)原理：原理：通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的選擇和制備一、抗原的選擇和制備A：樣品的制備：樣品的制備1組織：組織的處理方法

2、：組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS，0℃研磨，加入5STOPbuffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。2細(xì)胞：細(xì)胞的處理方法：離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mi

3、ns離心，取上清。加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于20℃保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。3分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入βME、溴酚藍(lán)制樣。B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因1.雙縮脲法：雙縮脲法是第一個(gè)用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利

4、的。雙縮脲法的原理是Cu2與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5gL～10gL含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1mNaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)0.5～2.5之間變化。所有的蛋白質(zhì)在230nm以下都有強(qiáng)吸收。例如，牛血清白蛋白

5、的α0.1%在225nm和215nm處分別為5.0和11.7，而在280nm處測為0.58。在230nm以下的強(qiáng)吸收是由于肽鍵的存在，因此，此值對所有的蛋白質(zhì)都是一樣的。從215nm和225nm處的光密度之差可用于測定濃度為10μlml～100μlml的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，這一公式是減去溶液中非蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生的誤差。但是，蛋白質(zhì)之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質(zhì)含量時(shí)，必須作適當(dāng)?shù)男ＵＳ?/p>

6、于蛋白質(zhì)的吸收峰常因pH改變而變化，所以在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，必須與樣品條件一致。4.Bradfd比色法：Bradfd比色法比Lowry法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。分別在兩組微量離心管中各加入0.5mgml牛血清白蛋白（5，10，15和20l），以0.15mmollNaCl補(bǔ)足至100l，同時(shí)以兩管100l的0.15mmollNaCl作空

7、白對照。每管各加入1ml考馬斯亮藍(lán)染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測A595，取A595吸光值對標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度作圖，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測量待測樣品的A595。從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測樣品的濃度。測定10100g的蛋白質(zhì)，要在較大試管中將染料溶液體積增大5倍進(jìn)行。樣品濃度過高，可稀釋后進(jìn)行，或在10100g另作一標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。5電泳估算法（我們選擇此法）：樣品倍比稀釋，SDSPAGE電泳，同時(shí)做定量marker