砷對(duì)鲇魚毒作用機(jī)理和抗砷相關(guān)基因克隆及功能分析.pdf

1、首次在黃河上游發(fā)現(xiàn)了黃河蘭州鲇魚的新分布群體。為了進(jìn)一步查清蘭州鲇魚和其它鲇魚的形態(tài)區(qū)別和生物學(xué)特性，以便于加大對(duì)瀕危物種保護(hù)，促進(jìn)繁衍力度，進(jìn)行了蘭州鲇魚的形態(tài)學(xué)，骨骼解剖學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，并首次繁育我國(guó)特產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蘭州鲇魚的苗種成功，使瀕危蘭州鲇的保護(hù)增殖和開發(fā)利用成為了現(xiàn)實(shí)。 本論文進(jìn)行了砷對(duì)鲇魚的毒作用機(jī)理研究。砷對(duì)鲇魚的生物化學(xué)影響研究結(jié)果表明，砷能使鲇魚腦、鰓、肝和骨骼肌肉中G-6-PDH和LDH活性顯著降低，說明在

2、As(Ⅲ)脅迫下磷酸戊糖途徑的效率降低，減少了磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH；LDH活性的降低是砷脅迫可能改變了酶的構(gòu)象，兩種酶活性的下降造成鲇魚組織損傷。被As(Ⅲ)染毒的鲇魚腦、鰓、肝和骨骼肌RNA逐漸降低，表明As(Ⅲ)可能抑制RNA合成；其蛋白質(zhì)含量逐漸減少，說明砷抑制了鲇魚核酸的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。撤離As(Ⅲ)染毒源后，鲇魚腦、腮、肝、骨骼肌的G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白質(zhì)含量能逐步恢復(fù)到對(duì)照水平，逆轉(zhuǎn)了As(Ⅲ)對(duì)鲇

3、魚的代謝酶、RNA和蛋白質(zhì)的影響，但是鲇魚體內(nèi)具有砷殘留。 通過研究As(Ⅲ)在鲇魚組織的累積與毒作用特征表明，魚可能具有比人類更強(qiáng)的抗砷能力。經(jīng)高、中、低濃度的As(Ⅲ)染毒鲇魚，測(cè)定鲇魚重要組織砷的累積量，表明鲇魚的腮和骨骼肌組織As(Ⅲ)富集量較高；肝臟中As(Ⅲ)累積量明顯低于其它組織，表現(xiàn)出對(duì)砷的抗性。 在小于0.1mg/LNaAsO2的水體中，鲇魚骨髂肌組織沒有在顯微鏡下觀察到組織損傷，且砷的累積量小于0

4、.05mg/kg(國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)是0.05mg/kg)，說明小于0.1mg/LNaAsO2的水體對(duì)魚和人類是安全的。在大于0.5mg/LNaAsO2的水體中，鲇魚骨骼肌中砷累積量可大于0.05mg/kg，而且顯微鏡觀察到組織有損傷，說明大于0.5mg/LNaAsO2的水體對(duì)魚可造成危害，肌肉中的砷富集可超過0.05mg/kg，可能對(duì)人體造成危害。 通過研究砷對(duì)鲇魚毒作用的組織病理變化發(fā)現(xiàn)，在大于0.5mg/LNaAsO2水體中鲇

5、魚腦、肝臟、鰓、骨骼肌具有不同程度的損傷，這種損傷具有濃度依賴性。小于0.1mg/LNaAsO2的水體對(duì)鲇魚組織沒有損傷，對(duì)環(huán)境和人具有安全。 本論文首次克隆了As(Ⅲ)誘導(dǎo)下鲇魚抗砷相關(guān)基因以及對(duì)其進(jìn)行了功能分析。從鲇魚提取RNA，分離獲得mRNA，構(gòu)建鲇魚cDNA文庫(kù)，進(jìn)行菌斑原位雜交，克隆出鲇魚3個(gè)新基因，分別命名為：SiRAS、SiATA、SiSERCA2。SiRAS核苷酸2718bp，編碼一個(gè)由906個(gè)氨基酸組成的蛋

6、白質(zhì)。SiATA核茁酸為1024bp，編碼一個(gè)由341個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。SiSERCA2核苷酸有2971bp，編碼一個(gè)由990個(gè)氨基酸組成的Ca2+泵-Ca2+-ATPase，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的重要蛋白質(zhì)之一。 SiRAS、SiATA分別與砷脅迫中具有重要作用的ars2、ArsA的相似性比較高，ArsA編碼膜相關(guān)的ATP酶結(jié)合砷泵排出As(Ⅲ)。SiSERCA2與質(zhì)膜上的Ca2+泵-SERCA2相似性比較高。Nor

7、thern雜交分析表明，SiRAS和SidTA在鲇魚腎、肝臟、腦、心臟、鰓、骨骼肌中都表達(dá)，只是SiRAS和SiATAmRNA在不同組織中累積量不同；其在腎中轉(zhuǎn)錄水平高，腦、肝臟、鰓轉(zhuǎn)錄水平低于腎，在心臟SiATAmRNA累積量低，在骨骼肌肉中SiATA轉(zhuǎn)錄水平最低。SiSERCA2僅在心肌和骨骼肌表達(dá)，在腎組織中不表達(dá)。同時(shí)SiRAS、SiATA、SiSERCA2的表達(dá)被砷誘導(dǎo)，SiRAS、SiATAmRNA積累的速度比較快，SiSE

8、RCA2mRNA累積的速度比較慢。Sorthern雜交分析表明，SiRAS、SiATA、SiSERCA2分別在鲇魚基因組中是單拷貝數(shù)。另外，SiRAS、SiATA、SiSERCA2都能在原核生物中高效表達(dá)，它們編碼的蛋白表現(xiàn)出了明顯的轉(zhuǎn)錄激活能力。這些結(jié)果表明SiRAS、SiATA、SiSERCA2參與砷脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 對(duì)鲇魚抗砷相關(guān)基因的研究將有助于系統(tǒng)、全面的了解生物抗砷的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以闡明它們的抗性機(jī)理，在基礎(chǔ)理論或